iPSC誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)用領(lǐng)域及培養(yǎng)指南

第三次醫(yī)學(xué)革命

iPSC
 

細(xì)胞療法是近年來醫(yī)藥研發(fā)中發(fā)展非常迅速的一個領(lǐng)域，其主要的治療方式為免疫細(xì)胞治療和干細(xì)胞治療。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，根據(jù)不同的分化潛能分類可分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、單能干細(xì)胞，其具有多向分化潛能、無限地分裂、增殖等特性。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）治療技術(shù)被譽(yù)為是繼藥物治療和手術(shù)治療之后的第三次醫(yī)學(xué)革命，是近年來國際醫(yī)學(xué)前沿重點發(fā)展領(lǐng)域，為整個干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域和臨床再生醫(yī)學(xué)提供了新的研究方向。

01  iPSC的定義
 

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)，又稱人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，是將一系列誘導(dǎo)因子導(dǎo)入到成熟體細(xì)胞中，并重編程為具有類似胚胎干細(xì)胞特征的一種多能干細(xì)胞。
iPSC可以通過CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)生同基因?qū)φ占?xì)胞系，在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞極為相似，具備和胚胎干細(xì)胞一樣的應(yīng)用潛能。
 

02   iPSC的優(yōu)勢

iPSC的致瘤系數(shù)遠(yuǎn)低于胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。
iPSC可以由成體細(xì)胞直接誘導(dǎo)而成，打破了干細(xì)胞研究中不可回避的倫理道德和免疫排斥等局限，為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和研究提供了一個全新視角。
iPSC與其他來源于人體的干細(xì)胞一樣，具有超強(qiáng)的分化再生能力、且免疫原性低。在再生醫(yī)學(xué)、篩選和開發(fā)新藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
由患者自身的細(xì)胞誘導(dǎo)獲得，因此極大地解決了潛在的免疫排斥問題。

03   iPSC的應(yīng)用

再生醫(yī)學(xué)：
iPSC具有超強(qiáng)的分化能力，在特定條件下，可誘導(dǎo)分化成人體所需的不同類型的細(xì)胞，甚至類器官；
疾病建模：
由于iPSC固有的自我更新特性和分化為體內(nèi)幾乎任何細(xì)胞類型的潛力，患者特有的iPSC可以提供大量與疾病相關(guān)的細(xì)胞和以前無法獲得的各種不同類型的細(xì)胞（如神經(jīng)元和心肌細(xì)胞），實現(xiàn)個性化的疾病建模，這將成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的核心部分；
新藥研發(fā)：
研究人員可以使用培養(yǎng)的干細(xì)胞來測試藥物的效用，了解藥物治療的可能性，這對研究人員新藥研發(fā)的助力是不可預(yù)估的。

疾病及衰老患者，通過iPSC再生醫(yī)學(xué)管理誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，用介入方式注入誘導(dǎo)多能干細(xì)胞使細(xì)胞器官功能恢復(fù)

04   iPSC培養(yǎng)指南

劃重點：
1.iPSC培養(yǎng)過程中不建議使用抗生素，抗生素會影響細(xì)胞的活性和分化潛能。
2.iPSC培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)與其它細(xì)胞隔離，兩次傳代后檢測支原體。

01基質(zhì)膠用于多孔板的包被：
（1）將Gelnest™基質(zhì)膠(干細(xì)胞專用)置于冰中并在4℃融化，使用預(yù)冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。

注：GelNest™基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白硫酸肝素糖蛋白等，更含有多種多種生長因子。這些成分可以提供細(xì)胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號，模擬生理環(huán)境中基底膜的特性，從而進(jìn)一步模擬生理環(huán)境中的細(xì)胞信號通路和互動，提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和效果。

（2）在冰上，將基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)液按照1:80或1:100的比例混勻，例如取1mL基質(zhì)膠加入80mL或100mL DMEM培養(yǎng)液中，使用預(yù)冷的移液管混合至均勻狀態(tài)。

注：可根據(jù)實驗具體情況調(diào)整稀釋比例。

（3）將6孔板置于冰上，按照每孔1mL向6孔板中加入稀釋后的基質(zhì)膠。
 

（4）將6孔板置于37℃孵育過夜。
注：一般情況下，孵育1小時即可使用，但過夜孵育的細(xì)胞培養(yǎng)效果更好。
（5）使用前吸出未結(jié)合的基質(zhì)膠。
注：需確保移液管的尖端不會刮傷涂層表面。

02 Y-27632 （ROCK抑制劑）溶液的配制
將Y-27632 溶于PBS中，配制成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液。
注：Y-27632的工作濃度為10µM。

03配制含Y-27632的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液（如mTeSR™1或TeSR™-E8™）
取Y-27632溶液與mTeSR™1培養(yǎng)液按照1:1000的比例混勻，例如取10µl Y-27632溶液加入10mL mTeSR™1培養(yǎng)液中，即得10mL含10µM Y-27632的mTeSR™1培養(yǎng)液。

04 iPSC復(fù)蘇：
（1）將凍存的iPSC置于37℃水浴迅速解凍，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用DMEM培養(yǎng)液沖洗凍存管兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中，與管中細(xì)胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（2）棄上清，用2mL含Y-27632的mTeSR™1培養(yǎng)液重懸iPSC，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板的1個孔中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注：建議將每支復(fù)蘇的細(xì)胞(約100萬個)轉(zhuǎn)移至6孔板的1個孔中培養(yǎng)使細(xì)胞存活率最大化。
（3）第二天對iPSC進(jìn)行換液，將含Y-27632的mTeSR™1培養(yǎng)液更換為不含Y-27632的mTeSR™1培養(yǎng)液。

注：可使用耐思新推出細(xì)胞復(fù)蘇儀替代原始細(xì)胞復(fù)蘇過程，細(xì)胞復(fù)蘇時間短，細(xì)胞存活率高。
 

05 iPSC傳代：

注：iPSC細(xì)胞生長至單層后會迅速分化并死亡，為保持其活性和多能性，需在長滿前進(jìn)行傳代。

（1）去上清，用1mL PBS洗滌1次，加入1mL適當(dāng)?shù)募?xì)胞消化液
（2）將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育3分鐘。顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞脫落，若細(xì)胞仍附著，可以用手輕輕拍打培養(yǎng)板底部使細(xì)胞脫落。
（3）將消化下來的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，用DMEM培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)板表面兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中，與管中的細(xì)胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（4）棄上清，用含Y-27632的mTeSR™1培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

06iPSC凍存：

NEST生物樣本庫系列含有全規(guī)格細(xì)胞凍存管及凍存液，操作簡單，安全無菌。
 

（2）參考細(xì)胞凍存液的相關(guān)步驟進(jìn)行細(xì)胞消化。（點擊閱讀原文獲取凍存液使用指南）
（3）計數(shù)，棄上清，加入適量凍存液，以每管1mL凍存液（約100萬個細(xì)胞）分裝至凍存管中。
（4）將細(xì)胞凍存管放置于可逐步降低溫度的NEST程序降溫盒內(nèi)并放置在-80℃冰箱內(nèi)，確保冷卻速度約為1℃/分鐘。通常冷卻速度不宜快于0.5℃/分鐘。
（5）放置在-80℃冰箱內(nèi)約24小時后轉(zhuǎn)移至液氮氣相中保存。
 

iPS細(xì)胞的成功誘導(dǎo)給細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)研究開辟了全新的道路。相信在不久的將來，iPSC技術(shù)能快速突破瓶頸，NEST也將持續(xù)研發(fā)新品，推動再生醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展，為患者帶來新生的希望！

05 NEST基質(zhì)膠選用指南