殘氧分析儀在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的在線氧含量監(jiān)測的應(yīng)用

哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中氧氣和pH的實(shí)時測量對于了解細(xì)胞培養(yǎng)物的代謝動力學(xué)非常重要。SDR SensorDish Reader® 可根據(jù)環(huán)境條件或毒理學(xué)損傷，跟蹤細(xì)胞耗氧量的時間過程。這種類型的監(jiān)測對組織工程和干細(xì)胞研究等其他應(yīng)用也有價值。

圖 1：用于在線監(jiān)測24孔多培養(yǎng)皿中溶解氧和pH值的SDR SensorDish® Reader

 

SDR SensorDish® Reader（圖1）可對24孔微量滴定板中的氧氣和pH值進(jìn)行非侵入式在線監(jiān)測。在本研究中，SDR用于監(jiān)測以4種不同細(xì)胞密度和不同氧張力（19%O2（圖2）和7%O2（圖3））。此外，還評估了線粒體調(diào)節(jié)劑對氧氣消耗率的影響(圖4)。以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）為代表性哺乳動物細(xì)胞類型，以羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）為代謝解偶聯(lián)劑，抗霉素為電子傳遞鏈抑制劑。

 

一、材料與方法

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）細(xì)胞在具有集成氧傳感器（OxoDishes®）的24孔多培養(yǎng)皿中生長。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件（5%CO2、35%濕度和37°C）下，將細(xì)胞維持在有10%熱滅活胎牛血清（FBS）、1%青霉素（10000 U/ml）/鏈霉素（10000µg/ml）、1%L-谷氨酰胺（200mM）、1%非必需氨基酸（10mM）和1%1M HEPES（pH 7.8）的Dulbeco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中。在所有情況下，細(xì)胞在Coy O2控制手套箱中的1ml培養(yǎng)基/孔中生長。在整個培養(yǎng)期間，使用SensorDish®Reader軟件按預(yù)設(shè)間隔監(jiān)測培養(yǎng)基中的氧濃度。

 

二、細(xì)胞密度的影響

第一個實(shí)驗(yàn)旨在研究細(xì)胞密度對細(xì)胞耗氧率和隨后培養(yǎng)基中pO2水平的影響。MEF細(xì)胞以三種不同的濃度(100,000;33,000;和10,000個細(xì)胞/cm2)以及“僅介質(zhì)”控制。在接近大氣中的氧氣水平(約為19% O2)下，每2分鐘測量一次，持續(xù)10小時。氧分布(圖2)清楚地顯示了細(xì)胞密度對每個處理的氧消耗水平的影響。觀察到的滯后時間< 1小時，推測系統(tǒng)正在與溫度和氧氣水平平衡。在此之后，所有細(xì)胞濃度都顯示出與“僅培養(yǎng)基”對照孔相比pO2水平的下降。最后，在孵育過程中，與“僅培養(yǎng)基”控制孔的偏差與最初接種的細(xì)胞數(shù)量成正比，這意味著個體細(xì)胞呼吸在所有測試的細(xì)胞密度下都是等效的。

圖2：不同密度MEF細(xì)胞培養(yǎng)液中pO2的平均水平(100,000;33,000;10,000和0細(xì)胞/cm2)，并暴露于約19% O2;每組N = 3

 

第二個實(shí)驗(yàn)旨在研究低氧環(huán)境對第一個實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞密度誘導(dǎo)觀察的影響。MEF細(xì)胞以三種不同的濃度(100,000;33,000和10,000細(xì)胞/cm2)以及“僅培養(yǎng)基”控制，然后放置在7% O2的環(huán)境中，每5分鐘監(jiān)測一次，持續(xù)10小時。氧氣分布證實(shí)了細(xì)胞密度對每次處理的氧氣消耗水平的影響(圖3)。觀察到短時間的溫度平衡(<1小時)，之后培養(yǎng)基中的剩余氧氣被細(xì)胞以密度依賴的方式消耗。即使是“僅介質(zhì)”在10小時后也不能在7% O2的新氧水平下完全平衡。然而，每次處理與“僅培養(yǎng)基”控制孔的偏差與所接種細(xì)胞的數(shù)量成正比。

圖3：不同密度MEF細(xì)胞培養(yǎng)液中pO2的平均水平(100,000;33,000;10,000和0細(xì)胞/cm2)，暴露于7%的O2;每組N = 3

 

三、線粒體調(diào)節(jié)劑的作用

第三個實(shí)驗(yàn)旨在研究特定線粒體調(diào)節(jié)劑對細(xì)胞耗氧量和隨后培養(yǎng)基中pO2水平的影響。MEF細(xì)胞以33,000個/cm2的速度接種，在培養(yǎng)皿上粘附4小時。然后將培養(yǎng)基替換為含有1µl/ml二甲亞砜(DMSO，對照物)的特定培養(yǎng)基;10µM羰基氰化物間氯苯腙(CCCP);或10µM抗霉素。然后在每個孔上加1ml礦物油，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(5% CO2, 35%濕度，37°C, 19% O2環(huán)境)孵育平板，每2分鐘監(jiān)測一次，持續(xù)10小時。氧譜顯示了處理對細(xì)胞耗氧量水平的顯著影響(圖4)。從3到4小時時間點(diǎn)的測量表明，在接受有劑量的培養(yǎng)基之前，處理的變化很小。在給藥30分鐘內(nèi)，兩組之間的耗氧量曲線出現(xiàn)了可觀察到的差異。DMSO對MEF細(xì)胞的平均氧含量變化不大。在約17.5% O2的條件下，形成了耗氧和吸氧之間的穩(wěn)定狀態(tài)�？姑顾厥请娮觽鬟f鏈絡(luò)合物III的抑制劑，可以明顯降低細(xì)胞的耗氧速率，使細(xì)胞處于比DMSO更高的穩(wěn)態(tài)。最后，CCCP(一種線粒體解偶聯(lián)劑)治療導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量明顯增加。

圖4：抗霉素、DMSO和CCCP作用4小時時MEF細(xì)胞培養(yǎng)液中pO2的平均水平;每組N = 4

 

四、結(jié)論

使用SDR SensorDish® Reader，我們監(jiān)測了哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基氧含量，并顯示了細(xì)胞密度依賴性耗氧量。在19%O2、7%O2下都能觀察到密度依賴性差異，這是一個更具生理相關(guān)性的氧氣水平。另外，不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基在7% O2條件下需要10小時以上才能達(dá)到平衡。因此，建議在所需的氧氣水平下對培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)孵育。最后，與對照組相比，CCCP增加了細(xì)胞需氧量，而抗霉素則減少了細(xì)胞需氧量。SDR SensorDish® Reader可以持續(xù)快速地定量介質(zhì)氧水平，可用于測量細(xì)胞需氧量和代謝功能。

 

實(shí)驗(yàn)來源：

Lynn S. G. and LaPres J. J.
Dept. of Biochemistry, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

 

 

 

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