生物反應器在通過小球藻的高密度異養(yǎng)培養(yǎng)實現(xiàn)葉黃素高效生產(chǎn)中的應用

葉黃素（Lutein）是人眼部視網(wǎng)膜黃斑部的主要色素。葉黃素對視網(wǎng)膜中的黃斑有重要的保護作用，是幫助眼睛健康發(fā)育的關鍵營養(yǎng)元素，人體無法通過自身合成，必須靠攝入葉黃素來補充。若眼睛缺乏葉黃素，會引起黃斑退化和視力模糊，甚至出現(xiàn)視力退化、近視、視網(wǎng)膜病變等癥狀，嚴重的可導致失明。



目前，金盞花是商業(yè)葉黃素生產(chǎn)的主要來源。然而，種植成本高、生長環(huán)境苛刻等因素在本質上限制了天然葉黃素的進一步開發(fā)利用。相比之下，微藻（microalgae）具有生長快、葉黃素含量高、培養(yǎng)環(huán)境要求簡單等特點，被認為是天然葉黃素最理想的來源。

 

小球藻(Chlorella sorokiniana)因其優(yōu)異的生產(chǎn)效率和對不同營養(yǎng)模式和廣泛培養(yǎng)條件的適應性而成為一種有商業(yè)前景的葉黃素生物合成菌株。

 

近期，福州大學生物科學與工程學院副研究員謝友坪老師在影響因子為11.4的《Bioresource Technology》雜志中發(fā)表了最新的研究成果“High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency”。在此研究中，研究人員采用異養(yǎng)培養(yǎng)的方法實現(xiàn)了小球藻FZU60高效生產(chǎn)葉黃素，最后在5L生物反應器（迪必爾生物）上做了放大培養(yǎng)。

結果顯示，通過在補料階段優(yōu)化營養(yǎng)物組分和濃度的方法，葉黃素的產(chǎn)量和生產(chǎn)速率最高達到了415.93 mg/L和82.50 mg/L/d。本研究提出了一種在藻類細胞中通過補料批次培養(yǎng)策略進行異養(yǎng)培養(yǎng)的方式，可以顯著提高葉黃素的生產(chǎn)性能，具有很大的工業(yè)應用潛力。

 

研究路線

 

#1 小球藻FZU60在搖瓶中異養(yǎng)生長性能的過程曲線
 

如圖1a所示，小球藻 FZU60在0-24 h期間處于適應階段，生物量生產(chǎn)速率較低。在24-58 h進入對數(shù)生長期，藻類生物量濃度(5.04 g/L)和生產(chǎn)力(2.04 g/L/d)在58 h達到峰值。在58 h之后，生物量濃度和生產(chǎn)速率均有下降，這可能是由于此時碳、氮源枯竭（圖1c），影響了細胞的C/N代謝，阻礙了藻類細胞的生長。

 

如圖1b所示，葉黃素含量隨著孵育時間的延長而增加，在120 h時達到最高水平(4.09 mg/g)。當培養(yǎng)基中碳源和氮源幾乎耗盡，葉黃素仍然在持續(xù)合成，可以推斷，葉黃素的合成不需要培養(yǎng)液中可用的氮源和碳源。

圖1 小球藻 FZU60在搖瓶中異養(yǎng)性能的時間過程

(a) 生物量濃度和生產(chǎn)力

(b) 葉黃素含量和生產(chǎn)力

(c) 硝酸鹽和葡萄糖濃度

 

#2 初始細胞濃度(ICC)在搖瓶內對小球藻 FZU60異養(yǎng)生長的影響

圖2 初始細胞濃度對小球藻 FZU60異養(yǎng)葉黃素產(chǎn)量的影響

 

如圖2所示，隨著ICC的增加，小球藻FZU60的生物量生產(chǎn)速率先升高后降低，在ICC為1.40 g/L時達到最大值2.42 g/L/d，葉黃素含量從3.90 mg/g逐漸增加到4.79 mg/g，葉黃素最大生產(chǎn)速率達到最高，為10.71 mg/L/d。說明在一定范圍內增加ICC有利于提高藻類細胞的異養(yǎng)生長速率和葉黃素的生成。因此，確定異養(yǎng)生產(chǎn)葉黃素的最佳ICC為1.40 g/ L。

 

#3 培養(yǎng)溫度對小球藻 FZU60在搖瓶中異養(yǎng)生長的影響

 

從圖3可以看出，小球藻 FZU60的生物量生產(chǎn)速率、葉黃素的含量及葉黃素生產(chǎn)速率在培養(yǎng)溫度從20℃升高到30℃后顯著增加，在30℃時，小球藻的生物量、葉黃素含量和生產(chǎn)速率達到最高，然后隨著溫度進一步升高到40℃均有下降，說明小球藻FZU60異養(yǎng)生長的最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

圖3 溫度對小球藻 FZU60異養(yǎng)葉黃素產(chǎn)量的影響

 

#4 在5L發(fā)酵罐中提高葉黃素產(chǎn)量的基于營養(yǎng)組分的補料分批策略

圖4 基于營養(yǎng)成分的不同補料策略對小球藻FZU60發(fā)酵培養(yǎng)液的影響

(a) 生物量濃度和

(b) 葉黃素含量

 

為了進一步提高小球藻 FZU60異養(yǎng)培養(yǎng)性能，研究了3種基于營養(yǎng)成分組成的補料批次策略(補料批次GN：濃縮葡萄糖(500 g/L)和硝酸鹽(175 g/L)；補料批次MN：濃縮培養(yǎng)基以硝酸鹽為氮源；補料批次MU：濃縮培養(yǎng)基以尿素為氮源)。如圖4a所示，補料批次GN、MN和MU的最大生物量濃度分別為16.07、54.71和98.40 g/L。補料批次MU的生物量濃度顯著高于補料批次GN和MN。補料批次MU的生物量生產(chǎn)速率達到17.96 g/L/d，分別比補料批次GN和MN高231.98%和59.36%(表1)。
 

表1 基于營養(yǎng)成分不同的補料策略下小球藻 FZU60異養(yǎng)性能比較

如圖4a所示，補料批次MN和MU的葉黃素含量從24 h到96 h逐漸增加，96 h后變化不大，而補料批次GN的葉黃素含量在24-72 h時約為2.30 mg/g，隨后急劇下降。最值得注意的是，補料批次MN的葉黃素含量始終超過補料批次GN和MU，且順序為補料MN >補料MU >補料GN。

 

然而，由于生物量濃度和生產(chǎn)力較高，補料批次MU的葉黃素產(chǎn)量和生產(chǎn)力分別達到289.20 mg/L和56.93 mg/L/d，高于補料批次GN和MN(表1)。綜上所述，補料批次MU是一種非常有效的提高小球藻FZU60異養(yǎng)生長性能的補料策略。

 

#5 基于營養(yǎng)濃度的5 L發(fā)酵罐高效生產(chǎn)葉黃素的批次補料策略

 

基于營養(yǎng)成分不同的補料策略研究結果表明，與補料GN和MN相比，補料MU的葉黃素產(chǎn)量和生產(chǎn)力更高。接下來以尿素為氮源，研究了三種不同營養(yǎng)濃度的培養(yǎng)基補料策略(補料批次1F：濃縮1倍；補料批次3F：濃縮3倍；補料批次6F：濃縮6倍)。
 

圖5 基于營養(yǎng)物質濃度不同補料批次策略下小球藻 FZU60發(fā)酵培養(yǎng)液的影響。

(a) 補料批次1F

(b) 補料批次3F

(c) 補料批次6F

 

如圖5所示，補料批次3F的最高生物量濃度在144 h達到186.86 g/L，分別比補料批次1F和6F提高了102.76%和44.83%，且順序為補料3F >補料6>補料1F。在整個培養(yǎng)過程中，補料批次1F的葉黃素含量從1.67 mg/g逐漸增加到4.09 mg/g。高于補料批次3F和6F策略的葉黃素含量，表明低濃度的營養(yǎng)成分有利于葉黃素在藻類細胞中的積累。這可能是由于底物的周期性和頻繁限制引起的應力效應。然而，補料批次3F獲得了極高的生物量濃度（161.82 g/L）、生物量生產(chǎn)速率（32.10 g/L/d）、葉黃素產(chǎn)量(415.93 mg/L)和葉黃素生產(chǎn)速率(82.50 mg/L/d) (表2)，分別比1F/6F飼料批次高51.88%、63.17%、52.98%和63.79%。

 

表2 基于養(yǎng)分濃度的不同投料策略下小球藻 FZU60異養(yǎng)性能比較
參考文獻：Xie Y, Zhang Z, Ma R, et al. High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency. Bioresource Technology. 2022 Dec; 365:128130. doi: 10.1016/j.biortech.2022.128130.

 

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關于實驗設備

文中提到的反應器是來自迪必爾生物的Intelli-Ferm A/B/Q 系列臺式發(fā)酵罐（圖6、圖7）
 

圖6 Intelli-Ferm A 臺式發(fā)酵罐
 

圖7 Intelli-Ferm B 臺式發(fā)酵罐

 

該反應器罐體（玻璃、一次性）體積覆蓋3L-15L，不僅滿足細菌、真菌的高密度培養(yǎng)，還可進行小球藻（Chlorella soroiniana）、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、雨生紅球藻(Haematococcus Pluvialis)等微藻類植物細胞的高密度培養(yǎng)（圖6c）。

 

此外，為了滿足微藻類植物細胞的光自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)三種模式，迪必爾生物對該系列生物反應器進行升級，開發(fā)出了T&J-Lux A攪拌式光照生物反應器（圖7）。
 

圖7 T&J-Lux A攪拌式光照生物反應器

 

反應器內置紅、藍、綠三種不同顏色的光源，可實現(xiàn)最高50000Lux的光照強度。與硬件匹配的軟件系統(tǒng)整合了光亮等級分步設計，可進行光亮參數(shù)梯度調節(jié)，同時可進行光暗比的循環(huán)控制，滿足不同微藻類植物細胞對光色類別、光色比例、光照強度和光暗周期等工藝參數(shù)的調整。