FRAP 系統(tǒng)在脂質(zhì)立方相（LCP）結(jié)晶條件的高通量篩選中的應(yīng)用

無論用戶使用的是可溶性蛋白還是膜蛋白，都需要篩選和優(yōu)化眾多結(jié)晶條件，以找到合適的結(jié)晶條件。在脂質(zhì)立方相 (LCP) 中成功結(jié)晶的主要因素之一是蛋白質(zhì)在脂質(zhì)雙層內(nèi)擴(kuò)散的能力。蛋白質(zhì)的擴(kuò)散速率受蛋白質(zhì)聚集、LCP 的結(jié)構(gòu)特性和化學(xué)環(huán)境的影響。擴(kuò)散速率可以通過光漂白后的熒光恢復(fù) (FRAP) 來確定，它測量標(biāo)記蛋白的熒光強(qiáng)度在經(jīng)過光漂白的 LCP 液滴中的一小塊區(qū)域內(nèi)重新恢復(fù)所需的時(shí)間量（圖1）。用戶可以繪制和分析歸一化熒光強(qiáng)度與時(shí)間的曲線，以量化兩個(gè)與蛋白擴(kuò)散相關(guān)的特性：遷移率（強(qiáng)度曲線漸近接近的值）和擴(kuò)散速率（與曲線起點(diǎn)處的斜率成比例） 。

圖 1. 1) 以預(yù)漂白樣品圖像作為基線熒光強(qiáng)度；2) 樣品通過一個(gè)小的（~15 微米直徑）激光光斑進(jìn)行光漂白。3) 隨著漂白分子向外擴(kuò)散和新分子向內(nèi)擴(kuò)散，監(jiān)測該漂白點(diǎn)內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

自動化 LCP-FRAP 儀器最初由斯克里普斯研究所開發(fā)，現(xiàn)在由 FORMULATRIX® 生產(chǎn)，極大地加快了LCP 板的篩選過程。用戶使用 FRAP 進(jìn)行篩選，無需等待數(shù)天到數(shù)周來確定晶體是否已形成， FRAP 給予了使用者即時(shí)觀察，以此判斷條件是否最適合結(jié)晶，同時(shí)排除那些由于擴(kuò)散速率不高而不會形成結(jié)晶的條件。雖然整個(gè) FRAP 過程仍然相對緩慢，每個(gè)蛋白液滴需要花 15-20 分鐘才能完成，但這樣需要的蛋白質(zhì)量相對較少。一種能夠避免每個(gè) LCP-FRAP 樣本的數(shù)據(jù)采集時(shí)間過長的方法便是僅收集終態(tài)熒光強(qiáng)度。

FRAP 系統(tǒng)通過使用這種三點(diǎn)數(shù)據(jù)收集方法（圖 2），可以依次漂白所有 96 個(gè)孔，然后返回收集熒光恢復(fù)圖像。雖然這種方法只能恢復(fù)樣本的遷移率，但研究人員仍然能夠僅依靠遷移率分析來識別潛在的結(jié)晶樣本。

圖 2. 高通量 FRAP 方法僅用于收集最終狀態(tài)熒光強(qiáng)度以確定樣本遷移率結(jié)果。

利用圖 3 所示的工作流程，F(xiàn)ORMULATRIX 的 RockImager-FRAP 可以在 50 分鐘內(nèi)完成 96 孔 FRAP 數(shù)據(jù)采集。

圖 3. 高通量 LCP-FRAP 數(shù)據(jù)采集流程圖

整塊結(jié)晶板的 FRAP 遷移率數(shù)據(jù)可以分組到具有顏色編碼背景的畫布視圖中，以便用戶快速識別結(jié)晶孔（圖 4）。然后，研究人員可以與軟件進(jìn)行交互，將孔標(biāo)記為結(jié)晶或非結(jié)晶。在大多數(shù)情況下，僅遷移恢復(fù)數(shù)據(jù)就足以讓研究人員識別潛在的結(jié)晶生成條件。盡管如此，人們可能仍希望生成完整的恢復(fù)曲線來檢查曲線形狀并確定擴(kuò)散速率。為避免通過完全恢復(fù)運(yùn)行所有 96 個(gè)樣本，此過程僅適用于用戶在三點(diǎn)高通量 FRAP 分析期間指定的那些潛在結(jié)晶生成孔。

圖 4. 收集的 FRAP 遷移率數(shù)據(jù)顯示在畫布視圖中，顏色編碼用于快速識別有無結(jié)晶生成可能。

可以繪制完整的強(qiáng)度恢復(fù)曲線并用貝塞爾函數(shù)擬合以得出擴(kuò)散速率和恢復(fù)時(shí)間。在大多數(shù)情況下，單個(gè) Bessel 函數(shù)足以實(shí)現(xiàn)低殘差擬合結(jié)果。在其余的大多數(shù)情況下，兩種不同類型的分子同時(shí)擴(kuò)散。這通常是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)沒有被充分純化，而脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都被熒光染料標(biāo)記。較小分子量的脂質(zhì)比大蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散得快得多。在這種情況下，必須使用雙分量 Bessel 函數(shù)擬合來準(zhǔn)確模擬兩種不同的擴(kuò)散速率。