單細胞轉錄組學在揭示肺部微浸潤性腺癌的分子特征與惡性潛能中的應用

影響因子17.52

研究背景
肺腺癌（LUAD）的發(fā)展被認為是從原位腺癌進展到微創(chuàng)腺癌（MIA），最終發(fā)展到完全浸潤性腺癌（IA）的。由于MIA的惰性生長模式和良好預后，手術切除被認為是治療MIA的首選。隨著靶向治療和免疫療法的發(fā)展，使癌癥死亡率進一步降低成為可能。然而，這些療法對MIA的療效尚不確定，目前它們不是治療MIA的首選。這突顯了解碼MIA分子性質的緊迫性，為這些治療提供合理的支持。

同時，有研究指出腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境（TME）的異質性在塑造腫瘤行為中起著至關重要的作用。因此，解碼MIA中腫瘤細胞與TME之間復雜的相互作用對于更好地了解維持MIA惰性本質和促進腫瘤進展的機制至關重要。

研究目的
隨著單細胞RNA測序（scRNA-seq）的出現，已有研究已經揭示了MIA和IA之間癌細胞和腫瘤微環(huán)境（TME）轉錄組的顯著差異，但由于患者之間的巨大差異，研究結果仍然存在不一致。這種現象的主要原因在于LUAD的進展受到多種因素的影響，包括遺傳和表觀遺傳特征、環(huán)境暴露、生活方式習慣、整體健康狀況等等。因此，本研究旨在消除這些混淆變量，探索 MIA腫瘤細胞性質，揭示TEM在其中的影響，從而為MIA和LUAD的治療發(fā)展提供新的生物學基礎。

研究結果
1. 對MIA和IA的腫瘤和免疫生態(tài)系統(tǒng)的scRNA-seq分析
本研究收集了三名未經治療的原發(fā)性LUAD患者的MIA和IA標本以及非腫瘤組織（N）和PBMC樣本，用于scRNA-seq。通過Seurat進行細胞分類和標記基因鑒定，并用UMAP方法進行了可視化，研究者將這些組織中的細胞簇歸類到了10個主要的已知細胞譜系中，包括單核細胞/巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞、T細胞、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、B細胞、樹突狀細胞（DC）、中性粒細胞和肥大細胞。從中發(fā)現，非免疫細胞的比例，主要包括上皮細胞粘附分子+ （EpCAM+）上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞，從N到MIA和IA樣本逐漸增加。其中，MIA中的非免疫細胞主要是內皮細胞（76%），而在IA中，它們大多是惡性上皮細胞（97%）。而免疫細胞的比例，MIA和N中分布相當，主要包括單核細胞/巨噬細胞、NK細胞和T細胞。但在IA內部，單核細胞/巨噬細胞的比率超過了前者兩個，而NK細胞的比率有所下降。此外，與前三種組織相比，PBMC顯示出免疫細胞組成很獨特，主要是由T細胞組成。

為了深入了解不同階段LUAD之間的分子變異，研究還對N、MIA和IA組織之間的基因表達譜進行了比較。結果發(fā)現，MIA與N之間差異表達基因（DEG）的數量與IA與MIA之間以及IA與N之間DEG的數量相比顯著減少。這表明MIA的基因表達譜更像N，而不是IA。此外，與N相比，在IA中上調的DEG主要存在于上皮細胞和內皮細胞中，而在MIA中上調的DEG主要存在于成纖維細胞中。以上結果表明，MIA和非腫瘤組織（N）具有相似的免疫生態(tài)系統(tǒng)，但與IA有著明顯的區(qū)別。
 

2. MIA惡性細胞的標志性特征的探索
接下來，研究者重點關注了N、MIA和IA組織中上皮細胞的轉錄組特征。通過比較它們的拷貝數變異（CNVs），可以發(fā)現MIA組織的CNV較低，表明MIA組織尚未完全表現出惡性特征。另外，又根據它們的主要標記基因將正常細胞簇分為5種不同的正常細胞類型：肺泡I型細胞（AT1）、Club/Clara細胞、肺泡II型細胞（AT2）、纖毛氣道上皮細胞（Ciliated）和基底細胞（Basal）。從中可以發(fā)現，正常細胞簇在患者之間是共享的，而惡性細胞簇則隨著患者的不同而變化，這突顯了惡性細胞特有的跨患者異質性。同時也可看出，源于MIA的細胞的轉錄組特征與源于正常組織的細胞更相似，而和源于IA的細胞差別較大。MIA的惡性細胞數量相對有限，主要由兩個細胞簇組成：乙醛脫氫酶3家族成員A1+（ALDH3A1+，C3）和補體C1q A鏈+（C1QA+，C15）細胞，這些細胞簇參與抗原處理和呈遞。相比之下，在IA中沒有出現主要的惡性細胞簇。此外，這些不同惡性細胞簇的生物過程和信號通路表現出顯著的差異。
 

接下來，研究者利用Monocle3的分析發(fā)現惡性細胞可能來自AT1、AT2和基底細胞。這三種細胞類型雖然起源不同，但在惡性腫瘤的后期過程中卻有著相似的演變路徑。同時，從中也發(fā)現了一個介于基底細胞和惡性細胞之間的中間細胞狀態(tài)，它僅由來自MIA的細胞組成。這個亞簇包括來自不同患者的細胞，因此可以排除潛在的跨患者異質性對演變路徑的影響。根據它們的擬時序，這些上皮細胞被分為九個階段，其中與MIA特異階段相關（第2階段）的獨特標記物也通過 “‘FindAllMarkers”’函數被分析確定了，分別為水通道蛋白1（AQP1）和血管緊張素II受體類型2（AGTR2）。與IA和N相比，這些基因在MIA上皮細胞中的表達顯著增加。通過調查AQP1和AGTR2在該研究scRNA-seq數據和一項公開的scRNA-seq數據中所有細胞類型的表達，可以發(fā)現幾乎所有同時表達AQP1和AGTR2的細胞都屬于上皮細胞。此外，這種高表達主要見于來自MIA樣本的細胞。這說明，AQP1和AGTR2的組合能夠有效地將MIA細胞與IA細胞區(qū)分開來。隨后，研究者試圖將這兩個標記物應用于來自The Cancer Genome Atlas（TCGA）數據庫的LUAD隊列，以區(qū)分具有MIA特征的肺癌患者與其他患者。結果發(fā)現，這兩個標記物成對共表達，并且其表達水平呈正相關。而且，高AQP1表達（AQP1+）和AGTR2表達(AGTR+)的患者比例在LUAD的T1階段比晚期（T4）顯著更高，這表明AQP1+AGTR2+的組合具有區(qū)分LUAD患者早期和晚期的高能力。此外，我們將T1階段中高AQP1+AGTR2+表達的患者定義為具有MIA特征的患者，發(fā)現他們與其他階段的患者相比具有更高的生存概率。研究者還用IF染色，測量了隊列中EpCAM+細胞中AQP1+和AGTR2+細胞的比例，發(fā)現EPCAM+細胞中AQP1+、AGTR2+和AQP1+AGTR2+細胞的比例顯著高于N和IA。以上結果表明，將AQP1和AGTR2的組合作為為MIA惡性細胞的標志特征，能夠精確地區(qū)分MIA和IA。
 

3. MIA 中被證實存在豐富的(GZMK)+ CD8+ T 細胞
研究者對T細胞進行了無監(jiān)督聚類，確定了13個子簇，并發(fā)現它們在患者之間以及IA、MIA、N和PBMC樣本內都是一致的。同時，結果表明，在MIA的癌前階段，LUAD微環(huán)境中缺乏成熟和功能性的CD4+ T細胞。此外，PBMC顯示出CD4+ T細胞亞群的不同組成，與前三種組織明顯不同。MIA樣本中CD8+ T細胞的比例與正常樣本相當，而IA樣本中CD8+ T細胞的比例低于MIA和正常樣本。此外，IA樣本中CD4+細胞毒性T細胞的比例也低于MIA和正常樣本，表明MIA的微環(huán)境具有足夠的細胞毒性，而IA的微環(huán)境的細胞毒性已經衰竭。為了進一步研究MIA和IA樣本中CD8+ T細胞的轉錄特征，研究者又比較了正常、MIA和IA樣本中CD8+細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的基因表達。DEG分析顯示，與MIA和正常相比，IA中的許多基因上調，而與IA和正常相比，MIA中只有少量基因上調。KEGG分析顯示，MIA中的CD8+ CTL的特征是細胞毒性、P53和NF-κB信號通路的上調，表明這些細胞在MIA微環(huán)境中功能良好。

擬時序分析表明，CD8+ T細胞起源于幼稚CD8+ T細胞，共享相同的轉變軌跡，但在PBMC、N、MIA和IA樣本中處于不同的狀態(tài)。PBMC中的CD8+ T細胞處于軌跡的開始，其次是來自MIA的一部分CD8+ T細胞和來自N的所有CD8+ T細胞。同時，IA中的CD8+ T細胞處于晚期狀態(tài)，而MIA中的一些CD8+ T細胞處于軌跡的末端。細胞毒性和衰竭評分顯示，過渡始于幼稚CD8+T細胞，然后通過以高細胞毒性和低耗竭為特征的中間狀態(tài)，最后達到以高衰竭和低細胞毒性為特征的狀態(tài)。另外，細胞毒性標志物GZMK的表達直到軌跡結束時才增加，這表明在MIA中存在一種特定的衰老CD8+T細胞亞群，其細胞毒性低但GZMK表達高（CytolowGZMK+），其比例明顯高于N、IA和PBMC中的比例。研究者后續(xù)又使用干擾素，確認了組織中CD8+ T細胞中GZMK+細胞的比例，證實相較于N和IA，MIA中更高豐度的GZMK+ CD8+ T細胞亞群。以上結果表明，CD8+ T細胞的數量和細胞毒性能力隨著LUAD的進展而降低，MIA中的CD8+ T細胞由功能性T細胞和功能失調的低細胞毒性GZMK+衰老亞群組成。
 

高表達的組織蛋白酶B（CTSB）+腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是LUAD MIA階段的早期應答者scRNA-seq數據表明，單核細胞/巨噬細胞是LUAD中最豐富的免疫細胞之一。偽時序分析顯示，來自N、MIA和IA的單核細胞/巨噬細胞在早期和中期階段遵循類似的轉變軌跡，但來自N和IA的巨噬細胞的轉變軌跡在晚期階段出現分歧，而MIA的轉變軌跡介于上述兩者之間。這表明MIA巨噬細胞具有雙重進化潛力。然后，GO分析進一步表明，MIA階段成熟巨噬細胞的功能與N階段相似，但與IA階段不同。這表明N和MIA中成熟巨噬細胞之間的相似性比MIA和IA中成熟巨噬細胞之間的相似性更接近。

另外，研究確定了巨噬細胞中期的兩種關鍵類型的TAM。其中一種TAM以分泌型磷蛋白1（SPP1）的高表達為特征，被稱為SPP1+ TAM，而另一種以CTSB的高表達為特征，被稱為CTSB+ TAM。GO分析表明，SPP1+TAM的功能主要集中在抗原呈遞上，而CTSB+TAM主要參與激活細胞外信號調節(jié)激酶通路。IA 中 SPP1+ TAM 細胞的比例高于 N，但 MIA 中 SPP1+ TAM 細胞的比例并不高于 N。相比之下，IA 和 MIA 中 CTSB+ TAM 細胞的比例均顯著高于 N，表明 CTSB+ TAM 細胞而非 SPP1+ TAM 細胞在 MIA 中起著至關重要的作用。經Gyorffy校正的719例LUAD患者的綜合數據集顯示，CTSB和SPP1的高表達水平與較差的生存率顯著相關，突出了CTSB+和SPP1+ TAM在LUAD進展中的關鍵作用。后續(xù)進一步的免疫熒光實驗，證實了MIA和IA中CTSB+ CD68+巨噬細胞亞群的高豐度，而在N中則沒有。由此可知， MIA中CTSB+ TAM被激活，而SPP1+ TAM未被激活，這可能在LUAD早期進展中起關鍵作用。
 

4. CTSB+ TAMs在MIA中表現出與CD8+細胞毒性T細胞的潛在相互作用
為了探究MIA中上皮細胞、T細胞亞群和TAM之間的特定細胞間相互作用，本研究采用了配體-受體相互作用工具CellChat推斷信號通路。結果發(fā)現， CTSB+和SPP1+ TAM在IA和MIA中都有很強的相互作用。而與IA不同，在MIA中，CTSB+ TAM的相互作用強度強于SPP1+ TAM，表明CTSB+ TAM在MIA起著更關鍵的作用。上皮本身以及SPP1+ TAM與上皮之間的相互作用在IA中很強，但在N的所有細胞類型之間都很平衡。在CD8+ CTL內以及CTSB+ TAM與CD8+ CTL之間可以觀察到SPP1+ TAM之間的強相互作用。

為了確認與CD8+CTL相關的特定信號變化，后續(xù)研究比較了CD8+CTL和其他細胞類型之間每對配體-受體之間的相互作用強度。我結果表明，主要組織相容性復合物I（MHC-I）在MIA中的相互作用強度明顯強于IA和N。由CTSB+TAM和SPP1+TAM表達的MHC-I配體和受體在MIA中比IA和N中更豐富�；�于以上結果可知，隨著CTSB+TAM和CD8+CTL之間相互作用強度和相互作用頻率的增加，MIA中CTSB+TAM的也會增加。因此，CTSB+TAM可能是MIA中CD8+CTL活化的原因。
 

研究總結
本文通過使用來自同步多原發(fā)LUAD患者的MIA和IA樣本，提供了MIA和IA之間腫瘤生態(tài)系統(tǒng)聯(lián)系和異質性的新證據。研究發(fā)現，與MIA和IA相比，PBMC內細胞群的亞型和數量存在顯著差異。因此，使用PBMC樣本在臨床環(huán)境中評估LUAD的可行性仍需要進一步調查和評估。另外，研究確認了免疫和腫瘤表型的差異，包括細胞類型和比例、癌癥細胞的獨特特征、T細胞和巨噬細胞的發(fā)育軌跡，以及腫瘤和免疫細胞之間的串擾。MIA腫瘤細胞表現出AQP1和AGTR2的高表達以及基底樣分子特征。同時，在MIA中，CTSB+ TAM可能會過度激活CD8+ T細胞，導致GZMK+衰老CD8+ T細胞富集，表明MIA的惰性外觀下可能存在惡性進展。這些數據可以成為理論依據，加深對維持MIA惰性特征和促進腫瘤進展的機制的理解，并協(xié)助開發(fā)更有效的治療靶點和策略，以治療MIA患者。

原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202303753

關于臨床樣本的單細胞懸液制備
目前，隨著單細胞RNA測序技術（scRNA-seq）在生物研究中的普及，其在各類臨床樣本中也得到了廣泛的應用。本研究憑借該技術，完成了對通過對LUAD 中不同階段組織樣本的轉錄組分析，從而確認了該疾病中細胞類型和比例、癌癥細胞的獨特特征、T細胞和巨噬細胞的發(fā)育軌跡，以及腫瘤和免疫細胞之間的相互作用。為了能盡可能完整地保留這些臨床樣本中的信息，一套合適、完善的單細胞懸液制備方案必不可少。

伯豪生物為此研究中的scRNA-seq提供了技術服務。我們的技術團隊憑借著大量的經驗積累，不斷創(chuàng)新樣本存儲和處理技術，自主研發(fā)了20余種樣本保存、處理試劑。結合肺癌組織的樣本特征和研究目標，我們優(yōu)化了實驗方案，成功協(xié)助研究團隊完成了這項研究。

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結果參考

伯優(yōu)®組織樣本懸液制備試劑盒適用于人和常見模式動物的多種類型樣本的單細胞懸液制備，通過預處理組織并進行酶解，組織 上的細胞會最大限度的被解離下來，經過過篩收集和離心等步驟，可高效獲得目的樣本的單細胞懸液。該試劑盒累計成功制備80余種組織類型的細胞懸液，細胞活力平均90%以上。

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