鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)在免疫沉淀中的應(yīng)用

鏈霉親和素 (Streptavidin/SA，分子量≈65 kDa，等電點(diǎn)≈6.0)，是從鏈霉菌 Streptomyces Avidinii 培養(yǎng)物中提取的一種分泌性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素是四聚體蛋白，也是一種生物素結(jié)合蛋白，包含四個(gè)亞基，每個(gè)亞基都有一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。一分子鏈霉親和素可以高度特異性地與四分子生物素結(jié)合 (圖 1)，二者的解離常數(shù) (kd) 約為 10-15，這種緊密而特異的結(jié)合非�？焖偾夷軌虺惺軜O端的 pH 值、溫度、有機(jī)溶劑和變性試劑。

▐ 案例 1：免疫沉淀 (IP)

為了證實(shí) Rab11a 是否在缺氧條件下的 MSC-sEV (間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的小細(xì)胞外囊泡)回收中發(fā)揮作用，作者使用了鏈霉親和素磁珠共沉淀生物素標(biāo)記的 MSC-sEV 及其在 NPC (髓核細(xì)胞) 中的相互作用蛋白，而陰性對(duì)照組設(shè)置為未標(biāo)記的 MSC-sEV。ALIX 是一種常用的 sEV 標(biāo)記物，用于檢測(cè)免疫共沉淀的 MSC-sEV。作者發(fā)現(xiàn)在常氧組和缺氧組中，Rab11a 均被鏈霉親和素磁珠共沉淀，但在生物素化的 MSC-sEV 或 NPC + 未生物素標(biāo)記的 MSC-Sev 組中則不然，這表明缺氧下 Rab11a 與內(nèi)化 MSC-sEV 之間的相互作用增強(qiáng) (圖 2)。

圖 2. 缺氧下 Rab11a 與內(nèi)化 MSC-sEV 之間的相互作用^[1]。

圖 3. CnHsf3 DBD 與線粒體靶向寡核苷酸探針互作分析環(huán)^[2]。
 

▐ 案例 3：RNA 免疫沉淀 (RIP)

圖 4. 正常葡萄糖處理的 HaCaT 細(xì)胞中 YTHDC1 蛋白和 SQSTM1 mRNA 的互作分析^[3]。

 Tips：如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素分子？

鏈霉親和素-生物素相互作用是已知最強(qiáng)的蛋白與其他分子間非共價(jià)的生物相互作用。許多應(yīng)用不需要從鏈霉親和素磁珠上解離生物素分子，如上述的 3 個(gè)案例。如需要解離，通常情況下都需要非常劇烈的方法 (此時(shí)鏈霉親和素已變性)。下述為 2 種方法舉例：

1）解離生物素化核酸：為了從鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在 pH 8.2 的 95% 甲酰胺+ 10 mM EDTA 中孵育磁珠，65°C 孵育 5 分鐘或 90°C 孵育 2 分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。
2）解離生物素化蛋白質(zhì)：對(duì)于生物素化蛋白質(zhì)，則可在 0.1% SDS 或 SDS-PAGE 緩沖液中煮沸磁珠 3 分鐘。



一分子鏈霉親和素可以高度特異性地與四分子生物素結(jié)合，從而放大弱信號(hào)，通過(guò)簡(jiǎn)單的工作流程即可提高細(xì)胞或組織內(nèi)中低豐度目標(biāo)的檢測(cè)靈敏度。鏈霉親和素可以與多種熒光染料/報(bào)告標(biāo)簽結(jié)合，同時(shí)生物素標(biāo)記抗體、酶的標(biāo)記率高且不影響蛋白的活性，因此鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)可用于幾乎所有的免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)。這些優(yōu)點(diǎn)使鏈霉親和素-生物素標(biāo)記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度，為微量抗原、抗體的檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑。

例如，熒光標(biāo)記的鏈霉親和素，如 Vari Fluor 488-Streptavidin，廣泛用于細(xì)胞表面標(biāo)記、熒光細(xì)胞分選 (FACS) 和其他熒光檢測(cè)成像應(yīng)用。

圖 5. Vari Fluor 488-Streptavidin 的免疫熒光染色。

除 Vari Fluor 488-Streptavidin 外，MCE 還可以提供多種 Vari Fluor 染料標(biāo)記的鏈霉親和素。這些 Vari Fluor 染料的發(fā)射光譜覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光和近紅外光，在多色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中能夠很容易地進(jìn)入細(xì)胞核和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)并標(biāo)記靶蛋白，進(jìn)行成像和分析。

參考文獻(xiàn)：
[1] Bide Tong, et al. Augmenting Intracellular Cargo Delivery of Extracellular Vesicles in Hypoxic Tissues through Inhibiting Hypoxia-Induced Endocytic Recycling. ACS Nano. 2023 Feb 14;17(3):2537-2553. 

[2] Xindi Gao, et al. Cryptococcal Hsf3 controls intramitochondrial ROS homeostasis by regulating the respiratory process. Nat Commun. 2022 Sep 15;13(1):5407.

[3] Diefei Liang, et al. m6A reader YTHDC1 modulates autophagy by targeting SQSTM1 in diabetic skin. Autophagy. 2022 Jun;18(6):1318-1337.