圖1: 點陣型LFA的靈活布置點的示意圖。
圖1:基于點的LFA的優(yōu)勢:由于風(fēng)影效應(yīng),沿著側(cè)向流動方向,每個點(體積>5納升,紅色圓圈)的強(qiáng)度逐漸減小。B 線性和點狀多重試驗的比較(左側(cè)為線性格式,右側(cè)為點狀格式):沿著側(cè)向流動方向,線和點的強(qiáng)度逐漸減小,在一個通道中依次排列(連續(xù)的點),而一個通道只有一個點則保持恒定的強(qiáng)度。C 使用Epson Perfection V600對B進(jìn)行定量讀取。灰度強(qiáng)度描述了在ImageJ中分析的8位圖像的像素值,絕對值是根據(jù)峰值下面積(AuP)確定的,與背景有所區(qū)別。
Unisart StructSure®膜的優(yōu)勢
樣品流體的流動動態(tài)對 LFA 的效果起著至關(guān)重要的作用,影響著分析物和抗體在系統(tǒng)內(nèi)的傳輸和相互作用。Unisart StructSure®膜提供了一種特定的流動模式,直接影響LFA的性能。根據(jù)Young-Laplace方程[Olanrewaju等人(2018)],毛細(xì)力與通道寬度呈反比關(guān)系。作為LFA的驅(qū)動力,較窄的通道會增加了樣品的流動性,需要更少的樣品體積來達(dá)到相同的流動距離。這在處理有限樣品量時非常有優(yōu)勢,使該測定方法更適用于稀缺樣品的應(yīng)用。此外,更大的驅(qū)動力導(dǎo)致流速增加,使分析物-檢測物-混合物更早到達(dá)捕獲抗體。將Unisart StructSure®膜與相同類型的常規(guī)非結(jié)構(gòu)化Unisart膜(CN140)和相同寬度進(jìn)行直接比較,水和血清通過膜的時間分別縮短了48%和35%,從而改善了粘性溶液的流動性。
此外,如Unisart StructSure®膜所示,將通道寬度從14毫米減小到每個通道寬度為2毫米的6個通道,可以促進(jìn)層流流動,因為雷諾數(shù)(Re)是預(yù)測流動狀態(tài)的參數(shù),隨著特征長度(在本例中為通道寬度)的減小而減小,表明雷諾數(shù)較低時出現(xiàn)層流流動。這種流體流動的特點是平滑而有序的流體層平行移動,提供了更可預(yù)測和可重現(xiàn)的流動曲線,這對于設(shè)計精確和可控的實驗至關(guān)重要。層流流動減少了分散,使得檢測成分的相互作用更加局部化和可控化!綤enis, et al. (2000)】此外,通過樣品與檢測試劑的受控混合,能促進(jìn)更有效的相互作用,從而增加靈敏度。為了實現(xiàn)這種混合,通過曲線形狀產(chǎn)生湍流,因為樣品的不同部分在曲線內(nèi)的通道外部區(qū)域附近承受的壓力會增加,因此速度變化,導(dǎo)致了分析物的擴(kuò)散(圖)【Krzyk, et al. (2018)】。流體內(nèi)增強(qiáng)的物質(zhì)聚集使得分析物與檢測器和捕獲抗體接觸,從而改善了結(jié)合。層流流動和湍流的受控產(chǎn)生的結(jié)合導(dǎo)致有益的流體動力學(xué),而過度的分散可能會影響檢測的準(zhǔn)確性。
圖2:Unisart StructSure®膜的流體動力學(xué)。窄通道在直線段提供層流流動,而在彎曲處由于速度變化而產(chǎn)生湍流。內(nèi)壁上的流速比外壁上的流速減小,導(dǎo)致流體重疊和旋渦。
波狀結(jié)構(gòu)的另一個特點是從普通膜的25毫米延伸到Unisart StructSure®膜的26.2毫米的吸收墊距離,為捕獲分子提供更大的距離,從而在分析物和探測器之間提供更長的孵育時間。根據(jù)實驗要求,這種延伸可以提供更靈活的實驗布局。
案例研究- 多重膿毒癥快速診斷試紙
Case study
多重膿毒癥是一種危及生命的疾病,當(dāng)機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)時,會導(dǎo)致全身性炎癥和器官功能障礙。及早準(zhǔn)確的診斷對于及時干預(yù)和改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前用于多重膿毒癥診斷的最常用生物標(biāo)志物是降鈣素原(PCT)C反應(yīng)蛋白(CRP),前者通常保持在較低的血液濃度,但在細(xì)菌感染(尤其是多重膿毒癥)時會顯著升高,后者則是一般的炎癥標(biāo)志物。由于CRP是一種敏感的標(biāo)志物,但對于膿毒癥不具有特異性,而PCT是一種特異性較高但敏感性較低的標(biāo)志物,二者的結(jié)合可達(dá)到平衡,改善多重膿毒癥診斷的敏感性和特異性。此外,PCT確保早期發(fā)現(xiàn)膿毒癥,并區(qū)分細(xì)菌性和非細(xì)菌性炎癥,從而提供更準(zhǔn)確和有針對性的治療決策。測量PCT和CRP的濃度可以提供關(guān)于膿毒癥嚴(yán)重程度的信息,有助于急性患者的管理和監(jiān)測。
表1: 用于檢測膿毒癥的生物標(biāo)志物,以血液濃度作為分界值。
借助它們互補(bǔ)的優(yōu)勢,本白皮書提出的方法用于建立一種多重免疫層析法(multiplex LFA),將PCT和CRP分別以三個濃度作為不同嚴(yán)重程度的膿毒癥的分界值(表1)。通過評估斑點的存在/不存在以及相應(yīng)的分界值,可以通過肉眼進(jìn)行半定量評估,但也可以通過使用sciREADER LF2 (SCIENION GmbH, 圖9)與集成的動力學(xué)測量算法進(jìn)行定量評估。
材料與方法
使用SCIENION的sciFLEXARRAYER SX(圖4)精密微量點樣儀,在Unisart CN 140
StructSure®(賽多利斯, 3UN14ER066S01WS)上打印多重陣列。簡而言之,按照圖 5 所示的檢測布局預(yù)埋10納升三種不同濃度的抗PCT和抗CRP抗體(HyTest)。第二種抗PCT和抗CRP抗體與碳納米顆粒結(jié)合,以夾心測定的形式檢測分析物PCT和CRP。
由于配備了兩個高分辨率攝像頭(圖4,水平攝像頭和垂直攝像頭),sciFLEXARRAYER系統(tǒng)可以完全控制液滴的生成,從而驗證噴點的質(zhì)量。通過將特定目標(biāo)靶標(biāo)成像為參考點,如同Unisart StructSure®膜(圖3)所示,能夠補(bǔ)償目標(biāo)位置和方向的變化。通過水平攝像頭監(jiān)測液滴的生成、液滴體積、質(zhì)量以及與軸定位的偏差,顯示出納米級的穩(wěn)定液滴(圖 4、5)。在噴點過程結(jié)束時,垂直攝像頭可對目標(biāo)進(jìn)行檢測,只有斑點符合特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的膜才能通過檢測。
大卡是通過使用一張背板(Kenosha牌)、印刷膜、吸收墊(Whatman CF5,Cytiva品牌)以及樣品應(yīng)用墊(玻璃纖維,Kenosha牌)組裝而成的。之后,使用剪切機(jī)(Matrix 2360剪切機(jī),Kinematic Automation公司)將卡片切割成14毫米寬的條形,確保每個膜結(jié)構(gòu)的完整性。將膜條放入由Sartorius和SCIENION GmbH 合作開發(fā)的完美貼合的卡殼中,然后涂上結(jié)合物和樣品的混合物,進(jìn)行試運行。孵育30分鐘后, 使用帶有集成分析軟件的sciREADER CL2(SCIENION GmbH公司)對條形進(jìn)行測量和分析。
sciFLEXARRAYER SX(SCIENION)是一種精密微量點樣儀,用于在Unisart CN 140 StructSure®膜上預(yù)埋抗體。箭頭和數(shù)字表示以下內(nèi)容的存在:(i)壓電式點樣毛細(xì)管;(ii)用于點樣后對膜成像的垂直相機(jī);(iii)用于可視化和量化滴液參數(shù)的高分辨率水平滴液相機(jī);(iv)膜的靶標(biāo)支架;(v)96孔板的位置,其中包含待點樣的抗體;(vi)控制sciFLEXARRAYER SX微量點樣儀的軟件的計算機(jī)屏幕。
結(jié)果與討論(提出的解決方案)
結(jié)構(gòu)化膜與精密微量點樣儀技術(shù)相結(jié)合可提高性能
可以通過眼睛進(jìn)行評估
在任何類型的膜上都可以在LFA上進(jìn)行基于點的多重檢測。由于該檢測的復(fù)雜性,通過眼睛來評估圖案可能具有挑戰(zhàn)性,因此建議使用讀取器進(jìn)行分析。由于Sartorius Unisart StructSure®膜的結(jié)構(gòu)設(shè)計,可以將視覺點與相應(yīng)的生物標(biāo)志物相對應(yīng),簡化評估過程而無需讀取器。在已建立的膿毒癥多重檢測實驗中,即使不是所有的點都出現(xiàn),也可以很容易區(qū)分膜結(jié)構(gòu)左側(cè)三個通道中CRP的三個點和右側(cè)PCT的點(圖5),從而確保半定量分析和對感染嚴(yán)重程度和類型(細(xì)菌性、非細(xì)菌性)的決策。小通道可更好地控制檢測區(qū)域內(nèi)不同的捕獲分子的位置。然而,由于點的大小,決定點存在與否仍然是主觀的,因此使用讀取器是有意義的。這種可指定的定位需要高精度的噴點,而 SCIENION的sciDROP PICO 點樣技術(shù)可以實現(xiàn)這一點。非接觸式點樣可確保膜的完整性,從而產(chǎn)生具有可控液滴量的均勻斑點,實現(xiàn)最佳的檢測性能。
圖5:Unisart StructSure®膜上的膿毒癥多重檢測:通過在截斷區(qū)域的相應(yīng)斑點的存在/缺失進(jìn)行半定量評估。1:鼠IgG,檢測對照;2:10 µg/ml CRP的臨界值(低);3:40 µg/ml CRP的臨界值(中);4:200 µg/ml CRP的臨界值(高);5:0.5 ng/ml PCT的臨界值(低);6:2 ng/ml PCT的臨界值(中);7:10 ng/ml PCT的臨界值(高)。
信號強(qiáng)度增強(qiáng)
如前所訴,由于反應(yīng)區(qū)域擴(kuò)大,結(jié)構(gòu)化膜提供了有利的流動動態(tài),并延長了分析物與抗體之間的孵育時間。與同批次的非結(jié)構(gòu)化Unisart® CN140膜相比,結(jié)構(gòu)化膜的信號強(qiáng)度增加了 52%,這與斑點位置有關(guān)(圖6)。
圖6:Unisart StructSure®與非結(jié)構(gòu)化膜的比較。A:非結(jié)構(gòu)膜(左圖)和 Unisart StructSure® 膜(右圖)上 10 納克/毫升 PCT 樣品斑點的半定量評估。藍(lán)色矩形內(nèi)的斑點用于B:Unisart StructSure®和非結(jié)構(gòu)化膜上0.5、2、10ng/ml PCT斑點強(qiáng)度的比較。
特定的卡殼裝置提高了檢測的可重復(fù)性并縮短了時間
專為Unisart StructSure®膜條尺寸設(shè)計的樣品盒支持流體動力學(xué)特性(圖7A)。通過確保材料之間的均勻過渡,卡殼裝置保證了所有通道中的控制和均勻流動,從而確保更高的重現(xiàn)性。這一點在信號強(qiáng)度尚未完全形成的孵育時間內(nèi)表現(xiàn)得尤為明顯,使用卡殼裝置而非松散的檢測棒孵育30分鐘后,膿毒癥多重LFA的CV值減少了10%(圖7 B)。因此,這種用于日常實驗室或家庭使用的即時檢測可以在較短的時間內(nèi)完成,而無需等待信號完全形成(此處為60分鐘)。
圖7:使用LFA盒改善流體動力學(xué)。(A)14毫米Unisart StructSure®和常規(guī)Unisart® LFA試劑盒的圖片,由Scienion GmbH和賽多利斯公司合作設(shè)計和制作。(B)與無卡殼情況下,30分鐘和60分鐘孵育后控制點信號變異系數(shù)(CV)的比較。每個變種測試了包括6個控制點的16個試紙條。
同時檢測豐度差異極大的分析物
除了已知的Sartorius Unisart®膜的質(zhì)量外,Unisart StructSure®膜的特性還允許在一根膜條上同時檢測濃度相差4-5個數(shù)量的豐度差異很大的分析物。當(dāng)將具有大量豐度差異的生物標(biāo)志物結(jié)合在所需測量范圍內(nèi)時,提高一個生物標(biāo)志物的靈敏度同時降低另一個生物標(biāo)志物的靈敏度可能具有挑戰(zhàn)性,因為大多數(shù)檢測成分(如樣品緩沖液、樣品體積、樣品稀釋、固相材料和流體動力學(xué))直接影響兩種檢測方法。通過添加與過量CRP分析物競爭結(jié)合的非標(biāo)記抗CRP抗體,可以顯著降低CRP實驗的靈敏度,而不會影響PCT檢測所需的靈敏度。通過改變各自的捕獲抗體濃度,可以區(qū)分ng/ml范圍內(nèi)的PCT濃度,同時檢測ng/ml濃度的CRP(圖8)。
圖8:調(diào)整捕獲抗體濃度以達(dá)到所需的靈敏度
A:在不同的CRP分析物濃度下,根據(jù)CRP捕獲抗體濃度和PCT分析物濃度的變化曲線,在臨界點的低、中、高三個位置進(jìn)行滴度測定。
B:在不同的捕獲抗體值下,可以區(qū)分CRP和PCT的臨界點。
注:CRP為C-反應(yīng)蛋白,PCT為降鈣素原。使用Unisart StructSure®膜可以對CRP和PCT臨界值進(jìn)行半定量評估,但使用SCIENION 的掃描儀技術(shù)可以更容易地區(qū)分臨界值上是否存在斑點。sciREADER LF2是一種便攜式掃描儀設(shè)備,專為 LFA 的動力學(xué)和終點分析而設(shè)計,尤其適用于分析由多個檢測器區(qū)域組成的斑點陣列,其強(qiáng)大的網(wǎng)格排列和斑點查找算法確保了分析的準(zhǔn)確性。用于檢測高表達(dá)血液標(biāo)志物(如CRP)的夾心免疫測定通常受到鉤狀效應(yīng)的限制。通過實時測量測試點和對照點的信號強(qiáng)度,可觀察到測試與對照比率(T/C)的變化,表明低濃度和極高濃度分析物的信號發(fā)展速度不同,而終點測量時的最終 T/C 值可能相同[Rey等(2017)]。這使得通過動力學(xué)測量來擴(kuò)展LFA的動態(tài)范圍成為可能。
此外,動力學(xué)還能在早期階段識別反應(yīng),一旦檢測到臨界值,可以立即停止測量,從而減少測定時間。由于信號強(qiáng)度的發(fā)展速率與夾心式或競爭性測定中的分析物濃度成正比或反比,因此可以使用不同測量點之間的斜率并參照預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測定,該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以在讀取程序中定義為參考。這樣,每次測試時就無需攜帶單獨的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即可進(jìn)行定量測定。
每通道檢測一個結(jié)合物,提高特異性
在全貼試劑盒中,結(jié)合物通常被分散并干燥到適合樣品溶解的墊上。在多重檢測法中,有多種方法可以將檢測抗體整合到一起,例如同時結(jié)合、單獨結(jié)合抗體的混合,同時將所有檢測器固定在釋放墊上,或者將單個結(jié)合物在墊上進(jìn)行空間分離。無論如何,在運行過程中,樣品-結(jié)合物混合物一起流過膜時,檢測抗體會混合在一起,從而存在交叉污染和非特異性的風(fēng)險。Unisart StructSure®膜的細(xì)分現(xiàn)在提供了全面分離相應(yīng)檢測物的新可能性,避免了非關(guān)鍵反應(yīng)抗體之間的接觸,從而提高了特異性。初步實驗結(jié)果表明,將結(jié)合物直接應(yīng)用到經(jīng)過預(yù)封閉的結(jié)構(gòu)化膜的一個通道中時,可以獲得有希望的結(jié)果,以避免膜與結(jié)合物之間的結(jié)合。此外,分隔的通道可在某些通道中放置疏水性障礙,以實現(xiàn)不同的反應(yīng)時間,以支持相應(yīng)生物標(biāo)記物-抗體動力學(xué),并滿足檢測不同濃度范圍的生物標(biāo)記物的要求。目前正在研究結(jié)合物從膜上溶解的能力和相關(guān)的檢測功能,以及通過對膜進(jìn)行疏水性處理來改進(jìn)對不同豐度生物標(biāo)記物的同時檢測。
致謝
作者衷心感謝未來診斷公司作為合作伙伴,在研發(fā)案例研究檢測方面進(jìn)行發(fā)明、創(chuàng)造和驗證體外診斷產(chǎn)品的合作。