非泛素化Midnolin蛋白酶體降解途徑助力藥物開發(fā)
泛素化，顧名思義，肯定需要泛素的參與。泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (UPS)，則同時與泛素和蛋白酶體有關(guān)。
真核細(xì)胞中的兩種主要降解系統(tǒng)：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和溶酶體降解系統(tǒng)。在真核細(xì)胞內(nèi)，80% 以上的蛋白質(zhì)的降解都依賴于“泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”。
這一降解過程可以分為兩個階段：(1) 給廢棄蛋白質(zhì)“貼標(biāo)簽”: 泛素與底物蛋白的相互作用，底物帶上泛素標(biāo)簽；(2) “標(biāo)簽”蛋白質(zhì)進(jìn)行“廢物處理”: 經(jīng)過泛素化修飾的蛋白質(zhì)被特定的蛋白酶體識別，從而被降解[1]。
圖 1. 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程[1]。
首先，泛素與 E1 (泛素激活酶) 共價結(jié)合，然后被轉(zhuǎn)移至 E2 (泛素結(jié)合酶) 上。接著，E3 (泛素-蛋白質(zhì)連接酶) 將泛素從 E2 轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，并在 E4 酶 (鏈延長因子) 的催化下延長鏈長，最終使底物蛋白帶上了泛素標(biāo)簽。相關(guān)調(diào)節(jié)顆粒可以識別連接在蛋白質(zhì)上的多泛素鏈標(biāo)簽，并啟動降解過程[1]。
蛋白酶體除了通過上述經(jīng)典的“泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”降解蛋白以外，還可以通過非泛素化修飾降解蛋白。例如，已有研究表明，F(xiàn)os 家族可通過泛素化依賴的和不依賴的兩種機(jī)制被降解[2]。但一直以來，關(guān)于 IEG 蛋白 (Immediate-early genes) 迅速靶向降解的機(jī)制，尚不清楚，直到……
近日，來自哈佛醫(yī)學(xué)院的 Michael E. Greenberg 教授團(tuán)隊在頂尖期刊 Science 上發(fā)布了一項突破性的研究成果。
Michael E. Greenberg 團(tuán)隊通過全基因組 CRISPR-Cas9 篩選調(diào)控 IEGs 蛋白穩(wěn)定性的基因，發(fā)現(xiàn)了一種哺乳動物中基本未被表征過的 Midnolin 蛋白，其可以促進(jìn)不同 IEGs 蛋白的蛋白酶體降解。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了一種全新的蛋白降解機(jī)制——Midnolin-蛋白酶體途徑。
圖 2. Midnolin-蛋白酶體途徑降解核蛋白過程[1]。
Midnolin 受多種因素誘導(dǎo)，包括生長因子和神經(jīng)元刺激。在細(xì)胞核內(nèi)，Midnolin 通過 C 端 α 螺旋 (αHelix-C) 與蛋白酶體結(jié)合，利用 Catch 結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)選擇性，并通過 N 端泛素樣結(jié)構(gòu)域 (Ubl) 促進(jìn)結(jié)合底物的降解 (圖 2)。研究發(fā)現(xiàn)，Midnolin-蛋白酶體途徑繞過典型的泛素化系統(tǒng)來實現(xiàn)許多核蛋白的選擇性降解[2]。
早期研究：Midnolin 最初由 T sukahara 等人在胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) (2000 年)[4]。
(1) 利用基因捕獲方法 (Gene trap) 和體外胚胎干細(xì)胞的選擇，確定了參與核仁神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因調(diào)控的新基因--Midnolin。
(2) Midnolin 編碼一種含有 508 個氨基酸 (aa) 的蛋白質(zhì)，其中包含一個泛素樣結(jié)構(gòu)域。
(3) 利用 Midnolin-綠色熒光蛋白 (GFP) 融合蛋白研究 Midnolin 在細(xì)胞內(nèi)的分布 。Midnolin 被發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核和核仁，但不在細(xì)胞質(zhì)中。核仁定位信號 (NLS) 為位于 Midnolin C 端區(qū)域的包含 28 個氨基酸的肽 (440-QQKRLRRKARRDARGPYHWTPSRKAGRS-467)。
▐ Midnolin 是 IEG 蛋白質(zhì)降解的調(diào)節(jié)劑
為了研究 IEGs 蛋白質(zhì)降解的機(jī)制，作者重點研究了兩種常見的來自不同蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子——EGR1 和 Fos。通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) EGR1 或 FosB GPS (The global protein stability) 報告基因的 HEK-293T 細(xì)胞系，并進(jìn)行了全基因組 CRISPR-Cas9 篩選，發(fā)現(xiàn) MIDN 是負(fù)調(diào)節(jié) EGR1 和 FosB 穩(wěn)定性的熱點基因。并發(fā)現(xiàn)敲除 MIDN 基因會增加 EGR1 和 FosB 穩(wěn)定性。
圖 3. Midnolin 是 IEGs 蛋白降解的調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)多種 IEG 蛋白的降解[2]。
A-C：遺傳學(xué)篩選顯示 Midnolin 是 IEGs 蛋白降解的調(diào)節(jié)。(A) 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) EGR1 或 FosB GPS 報告基因的 HEK-293T 細(xì)胞系并進(jìn)行全基因組 CRISPR-Cas9 篩選示意圖。(B-C) 遺傳篩選結(jié)果，顯示 MIDN 是負(fù)調(diào)節(jié) EGR1 和 FosB 穩(wěn)定性的熱點基因。D-G：Midnolin促進(jìn)生理環(huán)境中多種 IEG 蛋白的降解。(D-E) NIH/3T3 細(xì)胞中敲除/過表達(dá) Midnolin 對 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1 蛋白水平的影響; (F-G) 初級皮層神經(jīng)元中敲除/過表達(dá) Midnolin 對 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1 蛋白水平的影響。
此外，在 NIH/3T3 成纖維細(xì)胞 (圖 3D-E) 和初級皮層神經(jīng)元 (圖 3F-G) 中過表達(dá) Midnolin 降低了多種 IGEs 蛋白水平，如 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1，且敲除 Midnolin 結(jié)果與之相反。上述結(jié)果表明這些 IEGs 蛋白可能都通過 Midnolin 發(fā)生靶向降解。進(jìn)一步研究顯示，Midnolin 可能還參與了細(xì)胞核內(nèi)除 Fos 和 EGR1 外數(shù)百種其他轉(zhuǎn)錄因子的降解。
作者將內(nèi)源性 Midnolin 用 3xHA 標(biāo)記，進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn) Midnolin 可免疫共沉淀 19 S 調(diào)節(jié)顆粒和 20 S 核心顆粒體 (圖 4A)。同時，使用 MG132 (蛋白酶體抑制劑) 抑制底物蛋白的降解，發(fā)現(xiàn) Midnolin 與底物 c-Fos、FosB、EGR1 存在相互作用，且與 PSMD2 和 PSMA2 (分別為 19 S 和 20 S 蛋白酶體的組成部分) 存在相互作用 (圖 4B)。
(A) 將 3xHA 標(biāo)簽引入 HEK-293T 細(xì)胞中內(nèi)源性 Midnolin 的 N 末端。細(xì)胞用 MG132 處理 6 小時后進(jìn)行 3xHA-Midnolin 免疫沉淀，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。(B) Midnolin 免疫共沉淀蛋白酶體和 內(nèi)源 IEGs 蛋白。PMA: PKC 激動劑，誘導(dǎo) IEGs 的轉(zhuǎn)錄。(C) 內(nèi)源性 Midnolin 水平因抑制蛋白酶體而顯著增加，但不會因抑制泛素 E1 而增加。
此外，MG132 可增加 Midnolin 蛋白水平，但 TAK-243 (泛素 E1 酶抑制劑) 則不影響 Midnolin 蛋白水平 (圖 4C)，且 TAK-243 并不影響 Midnolin 對底物蛋白的降解，由此證明 Midnolin 降解蛋白不依賴于泛素化。
注：26S 蛋白酶體由中間一個圓柱形 20S 核心顆粒和兩端覆蓋的一個或兩個 19S 調(diào)節(jié)顆粒組成。
▐ Midnolin 含三個協(xié)同作用的結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)結(jié)合底物的蛋白酶體降解
作者通過使用人工智能平臺 AlphaFold 進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，顯示 Midnolin 蛋白包含三個穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域: 位于 N 末端的泛素樣結(jié)構(gòu)域 (Ubl)、含兩部分假對稱 (pseudosymmetric) 的“捕獲 Catch”結(jié)構(gòu)域、和一個位于 C 末端的長 α 螺旋 (α Helix-C) (圖 5A)。
接下來，作者使用免疫共沉淀實驗以確定 Midnolin 與底物和/或蛋白酶體相互作用所需的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，Ubl 結(jié)構(gòu)域的點突變/缺失/誘變對 Midnolin 與EGR1 或蛋白酶體的相互作用無影響，但 Catch 結(jié)構(gòu)域的缺失使得底物蛋白 (如 EGR1) 無法被沉淀下來 (圖 5C 左)，α Helix-C 或 NLS 結(jié)構(gòu)域的缺失使得蛋白酶體 (如 PSMD2) 無法被捕獲 (圖 5C 右)。
圖 5. Midnolin 包含三個結(jié)構(gòu)域，它們協(xié)同作用以促進(jìn)底物的蛋白酶體降解[2]。
(A) AlphaFold 預(yù)測的 Midnolin 結(jié)構(gòu); (B) 引入 Midnolin cDNA 的突變或截短的示意圖; (C) 使用 CMV 啟動子對 HEK-293T 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) 2XFlag Midnolin，用 10 μM MG132 處理細(xì)胞 6 小時，并進(jìn)行免疫印跡。
也就是說，Midnolin 通過 Catch 結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)蛋白相互作用，通過 α Helix-C 結(jié)構(gòu)域與 26S 蛋白酶體結(jié)合。同時，Midnolin 可通過其 Catch 結(jié)構(gòu)域結(jié)合底物內(nèi)的非結(jié)構(gòu)化區(qū)域 (unstructured regions)，并形成 β 鏈。雖然 Midnolin-蛋白酶體途徑可繞過泛素化系統(tǒng)來實現(xiàn)許多核蛋白的選擇性降解，但關(guān)于如何實現(xiàn)特異性的靶蛋白降解還有待深入研究。
本期小 M 帶大家回顧了經(jīng)典的泛素化蛋白質(zhì)降解過程，并介紹了一種全新蛋白降解機(jī)制 —— Midnolin-蛋白酶體途徑，該途徑可繞過泛素化系統(tǒng)來實現(xiàn)許多核蛋白的選擇性降解。小 M 相信，基于 Midnolin 的新型靶向蛋白降解類藥物將會被逐漸開發(fā)出來，用于神經(jīng)或精神疾病，癌癥等疾病的研究~
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蛋白酶體抑制劑 (IC50: 100 nM)，可誘導(dǎo)凋亡和自噬。 |
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泛素 E1 酶 (UBA1) 抑制劑，抑制蛋白泛素化。 |
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PKC 和 SphK 激活劑，可誘導(dǎo) IEGs 的轉(zhuǎn)錄。 |
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200+ 活性化合物，用于泛素化及相關(guān)疾病研究。 |
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參考文獻(xiàn)：
[1] Tai HC, et al. Ubiquitin, the proteasome and protein degradation in neuronal function and dysfunction. Nat Rev Neurosci. 2008 Nov;9(11):826-38.
[2] Gu X, et al. The midnolin-proteasome pathway catches proteins for ubiquitination-independent degradation. Science. 2023 Aug 25;381(6660):eadh5021.
[3] Obara Y, et al. Midnolin is a novel regulator of parkin expression and is associated with Parkinson's Disease. Sci Rep. 2017 Jul 19;7(1):5885.
[4] Tsukahara M, et al. Novel nucleolar protein, midnolin, is expressed in the mesencephalon during mouse development. Gene. 2000 Aug 22;254(1-2):45-55.
