細(xì)胞死亡的新途徑泛凋亡 (PANopotosis)詳述

在所有提出的程序性細(xì)胞死亡 (PCD) 形式中，細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡是最明確的，其復(fù)雜的分子機(jī)制負(fù)責(zé)細(xì)胞死亡的啟動(dòng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和執(zhí)行[1]。但實(shí)際上這三種途徑之間存在復(fù)雜的串?dāng)_。例如在無菌損傷和感染性疾�。ɡ�如甲型流感病毒 IAV 感染）中，研究人員觀察到所有三種 PCD 途徑的生化標(biāo)記物均被激活[1]。

2019 年，美國學(xué)者 Malireddi 將這種具有焦亡、凋亡和壞死性凋亡特征的新型死亡方式命名為泛凋亡，并提出先天性免疫傳感器 ZBP1 和 TAK1 激酶在泛凋亡小體復(fù)合物組裝的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。


 Tips：
泛凋亡(PANoptosis) 是由特定觸發(fā)器激活并 PANoptosome 復(fù)合物調(diào)節(jié)的炎癥性 PCD 途徑，其綜合了細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和/或壞死性凋亡的關(guān)鍵特征，這也是 PANoptosis 術(shù)語中 “P” “A” 和 “N” 的來源，但其不能被細(xì)胞焦亡、凋亡和壞死性凋亡中任意一種死亡方式單獨(dú)表征[1]。

多種蛋白質(zhì)可以形成調(diào)節(jié) PCD 的多蛋白復(fù)合物，其基于各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，可分為三類：傳感結(jié)構(gòu)域、組裝結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域[2]。 

▐ 泛凋亡小體: PANoptosome   
泛凋亡受到上游感受器和分子信號(hào)的級(jí)聯(lián)調(diào)控，這些傳感器和級(jí)聯(lián)信號(hào)組裝成一種多聚體復(fù)合物，即泛凋亡小體 (PANoptosome)。PANoptosome 及其上游的感受器不僅是下游分子的激活平臺(tái)，也是 3 種 PCD 途徑的啟動(dòng)“總開關(guān)”[4][5]。
PANoptosome 小體作為一種分子支架，允許參與焦亡、細(xì)胞凋亡和/或壞死性凋亡的關(guān)鍵分子進(jìn)行耦聯(lián)和結(jié)合[1]。傳感器蛋白在感知到病原體成分后，會(huì)介導(dǎo) RIPK3、RIPK1、CASP8、FADD等蛋白組裝成 PANoptosome 復(fù)合體，從而誘導(dǎo) PANoptosis[2][6]。
構(gòu)成 PANoptosome 小體的蛋白質(zhì)通�？煞譃槿�類：(1) ZBP1 和 NLRP3 作為假定的 PAMP 和 DAMP 傳感器，(2) ASC 和 FADD 作為適配器，以及 (3) RIPK1、RIPK3 、CASP1 和 CASP8 作為催化效應(yīng)器[2]。

圖 3. 泛凋亡小體及其通路^[4]。

 Tips：
(1) ZBP1 泛凋亡小體：Z-DNA 結(jié)合蛋白 1 (ZBP1) 是一種先天免疫受體，被鑒定為甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）的感受器和 IAV 感染期間細(xì)胞死亡的主要調(diào)節(jié)因子。在 IAV 刺激下，ZBP1 作為特異的感受器被激活，進(jìn)而觸發(fā) PANoptosome 的組裝[7][8]。ZBP1-PANoptosis 形成后，可以啟動(dòng)由焦亡、凋亡和壞死性凋亡成分組成的泛凋亡，最終導(dǎo)致溶解性炎癥細(xì)胞死亡，其特征是 Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8 的激活和 MLKL 的磷酸化[9]。
(2) RIPK1 泛凋亡小體：RIPK1 介導(dǎo)的泛凋亡小體主要由 RIPK1、ASC、Caspase-1、Caspase-8 和死亡相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白（fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD）構(gòu)成，最早由 Malireddi 教授團(tuán)隊(duì)提出。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn) TAK1 可作為 RIPK1-PANoptosome 的調(diào)控主開關(guān)，因?yàn)?TAK1 基因的缺失或者功能失活可以觸發(fā) RIPK1-PANoptosome 的組裝。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TAK1 的缺乏同樣可以誘導(dǎo) RIPK1 非依賴的泛凋亡通路的激活，后者主要由 RIPK3-MLKL 介導(dǎo)。
(3) AIM2 泛凋亡小體：其組成分子包括 AIM2、ZBP1、pyrin、ASC、Caspase-1、Caspase-8、RIPK1、RIPK3 和 FADD[10]。AIM2 炎性小體可感知雙鏈 DNA，AIM2 調(diào)節(jié)先天免疫傳感器 Pyrin 和 ZBP1 來驅(qū)動(dòng)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥細(xì)胞泛凋亡，在人類的正常發(fā)育、傳染性疾病、炎癥和腫瘤方面發(fā)揮重要作用。



說了這么多，這種 “三合一” 的復(fù)雜細(xì)胞死亡方式，又該如何研究及檢測的呢？

首先咱們來說檢測，由于泛凋亡綜合了細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和/或壞死性凋亡的關(guān)鍵特征，因此在進(jìn)行相關(guān)檢測時(shí)三方面缺一不可！
之前小 M 也為大家整理過相關(guān)的檢測方法，那么本期僅做整理，不再詳述。


 Tips：

泛凋亡檢測方法及指標(biāo)！

圖 4. 磷酸化的 NFS1 通過降低 ROS 水平來減弱鉑基化學(xué)敏感性，從而防止 PANoptosis^[11]。

圖 5. Oxaliplatin 聯(lián)合多種抑制劑的細(xì)胞活力及毒性測定^[11]。 

a-b: 對(duì)照和 NFS1 敲低 HCT116 細(xì)胞的細(xì)胞活力 (a) 和細(xì)胞毒性 (b) 評(píng)估; c-d: 對(duì)照和 NFS1 敲低 DLD1 細(xì)胞活力 (c) 和細(xì)胞毒性 (d) 評(píng)估。

為了進(jìn)一步證實(shí) PANoptosis 的發(fā)生，作者發(fā)現(xiàn) NFS1 敲低聯(lián)合 Oxaliplatin 治療顯著增加了死亡細(xì)胞的數(shù)量，包括指示細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡的 YP1 陽性細(xì)胞和指示細(xì)胞壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡或鐵死亡的 PI 陽性細(xì)胞 (圖 6: 左圖, a-b 和右圖 a-b)。

對(duì) HCT116 細(xì)胞的分析還表明，聯(lián)合組中從質(zhì)膜出現(xiàn)的大氣泡數(shù)量明顯高于陰性對(duì)照組、NFS1 敲低組和 Oxaliplatin 治療組，這表明細(xì)胞焦亡的發(fā)生 (圖 6: 左圖, a)。此外，NFS1 耗竭后進(jìn)行 Oxaliplatin 治療定量增加了早期/晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并顯著減少了活細(xì)胞的數(shù)量 (圖 6: 左圖, c-d 和右圖 c-d)。此外，在 NFS1 敲低組和 Oxaliplatin 治療組中檢測到的脂質(zhì) ROS 含量高于對(duì)照組。這種增加在聯(lián)合組中更為明顯，表明鐵死亡的發(fā)生 (圖 6: 左圖, e 和右圖 e-f)。因此，這些數(shù)據(jù)表明 NFS1 缺陷與 Oxaliplatin 聯(lián)合有助于 PANoptosis 的激活。

圖 6. NFS1 缺陷與 Oxaliplatin 治療協(xié)同作用，誘導(dǎo) PANoptosis^[11]。 

(左圖): a. 對(duì)照中可能發(fā)生凋亡或壞死性凋亡的 YP1+細(xì)胞（綠色）和可能發(fā)生凋亡、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡或鐵死亡的 PI+細(xì)胞（紅色）以及用 Oxaliplatin 處理的 NFS1 敲低 HCT116 細(xì)胞。底部顯示為明場，紅色箭頭表示從質(zhì)膜中出現(xiàn)的大氣泡; b. 對(duì) (a) 中的 YP1+ 和 PI+ 細(xì)胞進(jìn)行定量。c-d: 流式細(xì)胞術(shù) (c) 和采用膜聯(lián)蛋白 V/PI 染色的定量分析 (d)，在對(duì)照和用 PBS 或 Oxaliplatin 處理的 NFS1 敲低 DLD1 細(xì)胞中評(píng)估活細(xì)胞 (Annexin V- /PI-)、早期凋亡細(xì)胞 (Annexin V+ /PI-) 和晚期凋亡細(xì)胞的百分比 (Annexin V+ /PI+); e. 通過 BODIPY™ 581/591 C11 探針測定評(píng)估用 Oxaliplatin 處理的對(duì)照和 NFS1 敲低 HCT116 細(xì)胞中的脂質(zhì) ROS 水平。

(右圖): a. 對(duì)照中可能發(fā)生凋亡或壞死性凋亡的 YP1+細(xì)胞（綠色）和可能發(fā)生凋亡、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡或鐵死亡的 PI+ 細(xì)胞（紅色）以及用 Oxaliplatin 處理的 NFS1 敲低 DLD1 細(xì)胞。底部顯示為明場; b. 對(duì) (a) 中的 YP1+ 和 PI+ 細(xì)胞進(jìn)行定量; c. 使用膜聯(lián)蛋白 V/PI 染色進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，評(píng)估對(duì)照和用 PBS 或 Oxaliplatin 處理的和 NFS1 敲除 HCT116 中活細(xì)胞 (Annexin V-/PI-)、早期凋亡細(xì)胞 (Annexin V+/PI-) 和晚期凋亡細(xì)胞 (Annexin V+/PI+) 的百分比; d. (c)中活細(xì)胞 (Annexin V-/PI-)、早期凋亡細(xì)胞 (Annexin V+/PI-) 和晚期凋亡細(xì)胞 (Annexin V+/PI+) 的定量; e. 使用 BODIPYTM 581/591 C11 探針測定法評(píng)估Oxaliplati 處理的對(duì)照細(xì)胞和 NFS1 敲低 DLD1 細(xì)胞中的脂質(zhì) ROS; F. 本研究中用于 ROS/脂質(zhì) ROS 分析的策略。

本期小 M 為大家介紹了細(xì)胞死亡的新姿勢：泛凋亡 (PANopotosis)，一種炎癥性細(xì)胞程序死亡途徑。三種重要的泛凋亡小體 ZBP1-PANoptosomes、AIM2-PANoptosomes 和 RIPK1-PANoptosomes 在其中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，此外，小 M 為大家介紹了泛凋亡的檢測指標(biāo)，并通過文獻(xiàn)案例進(jìn)一步詳述。希望大家能夠有所收獲喔~