熒光素酶報告原理及其在基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控研究中的應用
盡管有些腫瘤或疾病確實是由于基因組本身遺傳信息改變所致，但是表觀調(diào)控有時能更好地闡述腫瘤或疾病發(fā)生的機制。在課題進展中，尤其是在確定表型之后，我們往往從表觀調(diào)控，或轉(zhuǎn)錄調(diào)控，或蛋白修飾的方向去研究表型發(fā)生的機制。差異基因與表型間的關(guān)系往往是比較容易確定的，機制的挖掘則相對復雜！全基因組篩選是表觀調(diào)控的一種策略，通過生信分析來挖掘關(guān)鍵基因也是一種策略。
一個完整的基因結(jié)構(gòu)包括諸多要素，比如編碼區(qū)，包括外顯子與內(nèi)含子；前導區(qū)，位于編碼區(qū)上游，相當于RNA5'末端非編碼區(qū)，含有調(diào)控區(qū)，包括啟動子和增強子等；尾部區(qū)，位于RNA3'編碼區(qū)下游，相當于末端非編碼區(qū)。基因編碼區(qū)兩側(cè)也稱側(cè)翼順序。前導區(qū)可調(diào)控基因表達，被定義為順式作用元件，包括啟動子、增強子、調(diào)控序列和可誘導元件等。順式作用元件本身不編碼任何蛋白，僅僅提供與反式作用因子相互作用位點。本質(zhì)是核苷酸序列，即DNA片段。
反式作用因子與特異的順式作用元件結(jié)合，參與基因表達調(diào)控的因子。編碼反式作用因子的基因與被反式作用因子調(diào)控的基因不在同一染色體上。反式作用因子有兩個重要的功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，這是反式作用因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的必需結(jié)構(gòu)。反式作用因子可被誘導合成，其活性也受多種因素的調(diào)節(jié)。這里的反式作用因子本質(zhì)上是蛋白。轉(zhuǎn)錄因子是反式作用因子的重要組成，可被誘導表達。
轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達起抑制或增強的調(diào)控作用。熒光素酶報告基因系統(tǒng)（Luciferase reporter）就是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。原理就是把啟動子序列克隆到Firefly luciferase之前，用感興趣的啟動子去啟動Firefly luciferase的表達。如下圖，想要研究IFNa或者IFNβ的表達調(diào)控，就把IFNa或者IFNβ的啟動子克隆到Firefly luciferase之前，內(nèi)參就是用TK基因的啟動子啟動Renilla luciferase的表達。
熒光素酶報告原理（Rachael Kenworthy et al. 2009. Nucleic Acids Res）
如果我們想要研究某個轉(zhuǎn)錄因子是否能與某一靶啟動子片段有作用。首先將靶基因啟動子或其他待研究基因調(diào)控元件插入到熒光素酶報告基因前方，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒。然后，將可以表達待檢測轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞；如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比；再加入特定熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光。通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
同時，為了減少細胞數(shù)目，細胞轉(zhuǎn)染和裂解效率等內(nèi)在因素對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因 (Renilla luciferase的質(zhì)粒pRL-TK作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)參對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化干擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑Ⅱ時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入反應試劑，將上述反應淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，同時進行第二次測量。那么，怎么用熒光素酶報告系統(tǒng)研究基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控呢？
2023年8月，國際知名學術(shù)期刊J Hematol Oncol發(fā)表一篇題為Synergistic efficacy of simultaneous anti-TGF-β/VEGF bispecific antibody and PD-1 blockade in cancer therapy的研究論文，其中使用Luciferase reporter體系檢測TGF-β/VEGF雙特異性抗體對TGF-β信號的阻斷效果。
實驗操作：96孔板中接種30000的A549或MDA-MB-231細胞，37℃過夜培養(yǎng)。第二天，每孔轉(zhuǎn)染0.2μg SBE4 luciferase reporter質(zhì)粒。24小時后，分別用10 ng/ml TGF-β1和106 pM的特異性抗體Y332D處理24小時；然后進行熒光報告檢測。
結(jié)果和結(jié)論：Research revealed that TGF-β mediates the transcription of Smad-Binding Element-containing luciferase reporter construct, SBE4-Luc. Therefore, SBE4 luciferase reporter assay was performed to test the blocking capability of Y332D on TGF-β/Smad pathway. The results showed that Y332D remarkedly blocked TGF-β1 signaling in A549 and MDA-MB-231 cells. Also, Y332D significantly antagonized TGF-β1-regulated EMT in A549 and MDA-MB-231 cells.
