一種具有強(qiáng)鍵程控功能水凝膠用于心肌梗死的適應(yīng)性修復(fù)研究

研究背景：

心肌梗死（MI）是全世界心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因。MI導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量損傷，最終破壞了心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致心臟功能障礙。傳統(tǒng)治療無(wú)法有效逆轉(zhuǎn)梗死后心肌組織的損傷和功能障礙�；�于水凝膠貼片（ECP）已被證明可以有效地構(gòu)建修復(fù)性微環(huán)境，從而在梗死心肌上橋接電和機(jī)械刺激，可以防止心肌變薄和擴(kuò)張，改善心臟功能。通過(guò)考慮和優(yōu)化生物相容性、機(jī)械性能和導(dǎo)電性等因素，ECP可以成功促進(jìn)心肌修復(fù)。

基于此，南方醫(yī)科大學(xué)邱小忠教授/王樂(lè)禹教授團(tuán)隊(duì)在《ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS》期刊發(fā)表題目為“A Strongly Robust Chitosan-Based Programmed Control Functional Hydrogel Improved Mitochondrial Function and Pro-Vascularization for Adaptive Repair of Myocardial Infarction”的研究文章。
 

本研究構(gòu)建了一種基于殼聚糖（CS）程序控制功能化的ECP（CS/TA@PAs-Eu），用于修復(fù)MI。CS作為一種生物相容性良好的多糖，具有良好的降解性，并且其含有的游離氨基可以引發(fā)陰離子交換，形成離子傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)將CS水凝膠中的氫鍵結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為可控制的，來(lái)構(gòu)建穩(wěn)定的機(jī)械性能，并滿足ECP的穩(wěn)健性要求。此外，通過(guò)引入具有抗氧化和促血管生成作用的天然小分子，如α-硫辛酸（TA）、原花青素（PA）以及功能性金屬離子Eu³⁺，可以進(jìn)一步改善ECP的生物活性和修復(fù)效果。該ECP利用冰模板輔助構(gòu)建CS水凝膠，并通過(guò)嵌入聚（TA）網(wǎng)絡(luò)、PAs的交聯(lián)作用以及PAs與Eu³⁺的螯合作用來(lái)增強(qiáng)其離子電導(dǎo)率、改善線粒體功能，并具有抗氧化和促血管生成特性，最終評(píng)價(jià)其對(duì)梗死心肌的治療效果及心功能的恢復(fù)情況。

研究方法：
文中采用64通道電標(biāo)測(cè)技術(shù)（Electrical Mapping，MappingLab Limited，UK）評(píng)估大鼠心臟左心室正常和梗死心肌邊界區(qū)域的傳導(dǎo)時(shí)間、速度、場(chǎng)電位振幅等電信號(hào)的變化。

研究結(jié)果：

1、CS/TA@PAs-Eu 水凝膠的制備和表征

首先，通過(guò)調(diào)控酸性到堿性環(huán)境的轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)了殼聚糖水凝膠的有序構(gòu)建，從而獲得了具有良好機(jī)械性能和柔韌性的水凝膠網(wǎng)絡(luò)。在低溫環(huán)境下，由于氫氧根離子的程序化滲透，通過(guò)冰晶模板的強(qiáng)聚合氫鍵形成了堅(jiān)固的水凝膠網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)方案1）。采用這種程序化氫鍵構(gòu)建的水凝膠表現(xiàn)出強(qiáng)大的機(jī)械穩(wěn)健性，有望為梗死心肌提供持久的機(jī)械支撐。同時(shí)，利用輔酶Q10的熱開(kāi)環(huán)效應(yīng)構(gòu)建了聚（TA）網(wǎng)絡(luò)，并引入PAs分子來(lái)構(gòu)建CS/TA@PAs-Eu水凝膠的雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)方案2）。
 

方案1. 低溫堿性滲透誘導(dǎo)的程序化氫鍵構(gòu)建CS水凝膠


方案2. 關(guān)于功能化CS水凝膠（CS/TA@PAs-Eu）構(gòu)建及其在心肌梗死修復(fù)中的應(yīng)用的示意圖說(shuō)明
 

通過(guò)冰晶模板的輔助構(gòu)建，水凝膠具有相互連接的大孔結(jié)構(gòu)。PAs的添加進(jìn)一步交聯(lián)了CS分子，導(dǎo)致孔結(jié)構(gòu)的縮小。TA的嵌入使得水凝膠呈現(xiàn)黃色，而PAs的均勻錨定則使水凝膠由黃色過(guò)渡為紅色。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CS/TA@PAs-Eu水凝膠具有良好的機(jī)械抗性和穩(wěn)健性，其通過(guò)程序化氫鍵構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)使得水凝膠具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。此外，水凝膠的大孔結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞的附著，并且對(duì)應(yīng)變具有良好的恢復(fù)能力。通過(guò)添加PAs和Eu³⁺，水凝膠的電導(dǎo)性得到提高，為其在心肌組織中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。這些結(jié)果證實(shí)，通過(guò)程序化氫鍵構(gòu)建的CS/TA@PAs-Eu水凝膠具有穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)（圖1）。
 

圖1. 水凝膠的數(shù)字照片和掃描電子顯微鏡圖像
 

2、體外CMs的成熟和功能化

接下來(lái)，評(píng)估水凝膠對(duì)心肌細(xì)胞（CMs）存活和成熟度的影響。結(jié)果表明，基于殼聚糖的水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性，能維持CMs的高存活率。添加了TA、PAs和Eu³⁺等功能組分后，水凝膠對(duì)CMs的存活和成熟度有進(jìn)一步促進(jìn)作用。此外，水凝膠的功能組分釋放效應(yīng)對(duì)CMs的生長(zhǎng)環(huán)境起到持續(xù)影響，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的成熟和功能化。在細(xì)胞水平上，水凝膠對(duì)CMs的α-肌動(dòng)蛋白和CX43蛋白表達(dá)具有積極影響，有助于細(xì)胞間的連接和電耦合，從而提高了細(xì)胞的自發(fā)收縮能力。這些結(jié)果證明了功能化水凝膠在促進(jìn)CMs存活和成熟方面的生物學(xué)效應(yīng)，為MI修復(fù)提供了新的治療策略。
 

圖2. 水凝膠上CMs的Live/Dead染色，并根據(jù)Live/Dead染色圖像定量測(cè)定細(xì)胞活力
 

3、水凝膠的抗氧化性能、線粒體保護(hù)功能及促血管化

隨后又評(píng)估了水凝膠的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)CS/TA@PAs-Eu水凝膠對(duì)多種自由基具有良好的清除效果，包括H₂O₂、·OH、·O₂−和DPPH。殼聚糖本身具有一定的抗氧化活性，而添加了TA和PAs后，水凝膠的抗氧化性能得到了進(jìn)一步增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，CS/TA@PAs-Eu水凝膠能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS，改善線粒體功能，并提高細(xì)胞的ATP水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，CS/TA@PAs-Eu水凝膠用于清除MI微環(huán)境中的過(guò)量ROS，并改善線粒體功能具有潛力。
 

緊接著評(píng)估水凝膠對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的影響，特別是其對(duì)血管再生的作用。結(jié)果顯示，CS/TA@PAs-Eu水凝膠具有良好的生物相容性，能促進(jìn)HUVEC管道形成并增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。此外，添加Eu³⁺可以改善水凝膠對(duì)HUVEC的存活率，同時(shí)促進(jìn)血管生成。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明所構(gòu)建的功能性水凝膠具有改善梗死心肌血管再生的潛力。
 

圖4. 水凝膠處理下HUVECs的Live/Dead染色和細(xì)胞增殖活性

4、水凝膠對(duì)梗死后心功能的改善

接下來(lái)評(píng)估水凝膠對(duì)心肌梗死后心臟功能的恢復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水凝膠處理能改善大鼠的存活率，并顯著增強(qiáng)心臟的收縮活動(dòng)和壁厚。特別是CS/TA@PAs-Eu水凝膠處理組表現(xiàn)出最顯著的修復(fù)效果。此外，水凝膠還抑制了心肌組織的纖維化，并保持了心室壁厚度。這些結(jié)果表明，CS/TA@PAs-Eu水凝膠有望通過(guò)促進(jìn)心臟泵血能力、抑制心室重塑以及對(duì)梗死心肌的修復(fù)，改善心力衰竭（圖5）。
 

圖5. 水凝膠植入前后的心臟的超聲心動(dòng)圖圖像
 

CS/TA@PAs-Eu水凝膠在心肌梗死（MI）修復(fù)過(guò)程中的改善效果可以歸因于其多方面的干預(yù)作用。MI后早期的炎癥反應(yīng)是病理性ROS誘導(dǎo)的，主要源自受損的線粒體。因此，評(píng)估不同水凝膠處理組梗死心肌中線粒體形態(tài)的變化，結(jié)果顯示，CS/TA、CS/TA@PAs和CS/TA@PAs-Eu水凝膠能更好地保護(hù)線粒體的完整性，減輕ROS對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，并防止心肌細(xì)胞凋亡和損傷。此外，水凝膠處理顯著降低了梗死心肌中ROS水平，并促進(jìn)了電-收縮耦合的恢復(fù)，維持了心肌電生理功能（圖6）。對(duì)梗死心臟中電信號(hào)傳導(dǎo)的測(cè)量結(jié)果顯示，CS/TA@PAs-Eu水凝膠對(duì)電信號(hào)傳導(dǎo)的改善效果最為顯著（圖S15）。水凝膠處理還促進(jìn)了梗死心肌的血管生成，并通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)抑制纖維化�？偟膩�(lái)說(shuō)，CS/TA@PAs-Eu水凝膠的功能成分持續(xù)釋放有助于改善MI修復(fù)的多個(gè)方面，包括線粒體功能、抗氧化和促血管生成。此外，水凝膠在主要組織（肝臟、脾臟、肺和腎臟）中的生物安全性在植入后4周進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示每組主要器官的組織切片沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明水凝膠在體內(nèi)具有良好的生物相容性。
 

圖6. MI三維線粒體結(jié)構(gòu)的透射電鏡圖像


圖S15. 使用64通道電標(biāo)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)梗死4周時(shí)不同組Langendorff灌注心臟的電標(biāo)測(cè)圖像，以及梗死部位記錄的局部場(chǎng)電位電圖
 

綜上，CS/TA@PAs-Eu水凝膠可有效改善心肌梗死的修復(fù)。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CS/TA@PAs-Eu水凝膠具有較強(qiáng)的機(jī)械性能和生物相容性，有助于心肌細(xì)胞的成熟和功能化。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，該水凝膠表現(xiàn)出對(duì)心肌梗死的適應(yīng)性修復(fù)作用，包括改善線粒體功能、抗氧化、電生理重建和促進(jìn)血管生成等方面�？偟膩�(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究為MI的治療提供了一個(gè)新的潛在方案。