腸道微生物代謝物 IDA 通過抑制鐵死亡促進(jìn) CRC 的發(fā)展

提起腸道微生物，大家都會(huì)不約而同地想到菌群，研究較多的 “腸腦軸” 等等，也是近年來的熱點(diǎn)話題。但其實(shí)不同的腸道微生物代謝物也能促進(jìn)和預(yù)防癌癥發(fā)展！

2024 年，Nature Cell Biology 在線發(fā)表題為“Gut microbial metabolite facilitates colorectal cancer development via ferroptosis inhibition”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)從腸道微生物厭氧消化鏈球菌 (Peptostreptococcus anaerobius) 中提取的色氨酸代謝物，反式-3-吲哚丙烯酸 (IDA)，能夠通過抑制鐵死亡 (Ferroptosis)，促進(jìn)結(jié)直腸癌 (CRC) 的發(fā)展[1][2]。

圖 1. 腸道微生物代謝物對(duì)癌癥發(fā)展的影響^[1]。

羅伊氏乳桿菌 (L. reuteri) 釋放色氨酸代謝物吲哚衍生物 I3A (Indole-3-aldehvde)。促進(jìn)產(chǎn)生 IFNγ (干擾素 γ) 和 GzmB (表達(dá)顆粒酶 B) 的 CD8⁺ T 細(xì)胞，從而增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICI) 效果。色氨酸衍生物 IDA 源自 P. angerobius，通過抑制鐵死亡促進(jìn) CRC 的發(fā)展。IDA 是 AHR 的內(nèi)源性配體，直接調(diào)節(jié)基因 ALDHIA3。然后，該酶產(chǎn)生 NADH，并通過 NADH 介導(dǎo)的 CoQ 還原來促進(jìn) FSPI 調(diào)節(jié)的抗鐵死亡。
 

腸道微生物代謝物對(duì)癌細(xì)胞鐵死亡能有啥影響？這不，Cui 等人進(jìn)行了篩選，確定了 IDA 可作為 RSL3 誘導(dǎo)的鐵死亡的新型抑制劑。在 HT1080 細(xì)胞和 HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞中，只有 IDA 可以有效地抑制細(xì)胞鐵死亡，而其他色氨酸衍生物并未表現(xiàn)出類似的實(shí)質(zhì)性作用 (圖 2B)。通過 C11-BODIPY 581/591 染色檢測了細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平，發(fā)現(xiàn) IDA 處理可顯著抑制 HT29 細(xì)胞和 MC38 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡和脂質(zhì)過氧化 (圖中未顯示)。

同時(shí)，在 HT29 3D 腫瘤球體和類器官中也觀察到類似的結(jié)果：IDA 或 Liproxstatin-1 (Lipro-1)在很大程度上抑制了 RSL3 或 IKE (imidazole ketone erastin) 誘導(dǎo)的 HT29 腫瘤球體的鐵死亡 (圖 2C)。此外，通過異種移植模型，IDA 顯著消除了脂質(zhì)過氧化并促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。其在 C57BL/6J 小鼠中也顯示出對(duì)鐵死亡的強(qiáng)大抑制作用，并促進(jìn) MC38 異種移植的進(jìn)展 (圖 2D)。

圖 2. IDA 作為鐵死亡抑制因子的鑒定^[2]。

(A) 篩選方法示意圖；(B) 用 RSL3 和 50 μM 色氨酸代謝物 (Tryptophan、IDA、IPA、3-Indole、IAA、IAld 和 ILA) 處理 24 小時(shí)的 HT1080 細(xì)胞或 HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力；(C) HT29 三維腫瘤球體和類器官的代表性圖像，用 IKE (10 μM)、IDA (100 μM) 和 Lipro-1 (1 μM) 處理48小時(shí)；(D) C57BL/6J 小鼠中 MC38 荷瘤分析。

吲哚代謝物是 AHR (Aryl hydrocarbon receptor) 的天然配體。那么 AHR 就有可能參與 IDA 調(diào)節(jié)的鐵死亡抑制，研究人員使用 AHR 拮抗劑 BAY-218 和 StemRe-genin 1  (SR1)，發(fā)現(xiàn) AHR 拮抗劑顯著地消除了 IDA 調(diào)節(jié)的鐵死亡抑制 (圖 3A)。同時(shí)，通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除 AHR (圖 3B)，由于缺乏 AHR 表達(dá)，IDA 未能抑制鐵死亡(圖 3C-D)。此外，生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，證實(shí) IDA 是 AHR 的內(nèi)源性配體。IDA-AHR 的相互作用在 IDA 促進(jìn)的抑制鐵死亡過程中起著重要作用。

圖 3. AHR 和 FSP1 是 IDA 抑制鐵死亡所必需的^[2]。 

(A) 用 RSL3、IDA (50 μM)、BAY-218 (10 μM)和 SR1 (10 μM) 處理 24 小時(shí)的HT29 細(xì)胞的細(xì)胞活力。(B) 表達(dá) sg-ctrl 或 AHR-sg 的 HT29 細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析。(C-D) 用 RSL3 (5 μM) 和 IDA (50 μM) 處理指定時(shí)間的表達(dá) sg-ctrl 或 AHR-sg 的 HT29 細(xì)胞的細(xì)胞活力 (C) 和脂質(zhì)過氧化 (D)。(E) 對(duì)照細(xì)胞和 FSP1 KO HT29細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析（左）；用指定濃度的 IDA (5-500 μM) 和 RSL3 (5 μM) 處理 24 小時(shí)后 HT29 FSP1 KO 細(xì)胞的細(xì)胞活力（右）。(F) 異位表達(dá) FSP1 的 HT29 FSP1 KO 細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析（左）；用 RSL3 (5 μM) 和 IDA (50 μM) 處理的具有異位表達(dá) FSP1 的 HT29 FSP1 KO 細(xì)胞的細(xì)胞死亡（右）。(G) 每日 IDA (50  mg/kg) 的 nu/nu 小鼠中 HT29 WT 和 FSP1 KO 異種移植物的腫瘤圖像。

如圖 3E 所示，F(xiàn)SP1 KO 的 HT29 細(xì)胞在很大程度上消除了 IDA-AHR 軸的保護(hù)作用，而 WT HT29 細(xì)胞對(duì) IDA 介導(dǎo)的鐵死亡抑制有顯著反應(yīng)。同樣，HT1080 細(xì)胞中 FSP1 的缺乏完全阻斷了 IDA 的作用。而 FSP1 的異位表達(dá)挽救了這種表型(圖 3F)。此外，給予 IDA 促進(jìn)了 HT29 WT 細(xì)胞中的腫瘤發(fā)展，而 IDA 的作用在 FSP1 KO 細(xì)胞中基本消除 (圖 3G)，表明 IDA-AHR 軸介導(dǎo)的鐵死亡依賴于 FSP1。

FSP1 如何參與 IDA-AHR 介導(dǎo)的鐵死亡作用？這其中又是否有其他基因參與調(diào)節(jié)呢？

為了解開疑惑，作者對(duì) IDA 處理的 HT29 細(xì)胞進(jìn)行了 RNA 測序。在 IDA 可能介導(dǎo)的基因中，ALDH1A3 是上調(diào)最多的 (圖 4A)。RT-qPCR 和 Western blotting 分析證實(shí)，IDA 處理后，ALDH1A3 的信使 RNA 和蛋白質(zhì)水平顯著增加 (圖 4B-C)，但在其他色氨酸代謝產(chǎn)物處理中沒有顯著變化，表明 ALDH1A3 可能是 AHR 的直接下游靶點(diǎn)。此外，ALDH1A3 表達(dá)降低會(huì)損害 IDA 抑制鐵死亡的能力: ALDH1A3 的缺失顯著抑制了腫瘤的進(jìn)展，阻斷了 IDA 促進(jìn)的腫瘤生長 (圖 4D)。

那二者又是如何結(jié)合發(fā)揮作用呢的？該團(tuán)隊(duì)尋找 ALDH1A3 啟動(dòng)子周圍潛在的 AHR 結(jié)合位點(diǎn)。通過與共有的 AHR 結(jié)合基序 (GCGTG) 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在 IDA 處理時(shí)，內(nèi)源性 AHR 在 ALDH1A3 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) (TSS)上游約 100 bp 處對(duì) R3 表現(xiàn)出強(qiáng)的結(jié)合親和力，但對(duì) R1 或 R2 不表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合親和力，表明在 IDA 激活 AHR 的情況下，AHR 在 ALDH1A3 啟動(dòng)子上募集 (圖 4E)。

圖 4. IDA 通過 AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10 軸抑制鐵死亡^[2]。 

(A-C) HT29 細(xì)胞中 IDA (50 μM) 處理可能調(diào)節(jié)的 12 個(gè)主要基因的熱圖 (A)，處理后 ALDH1A3 的相對(duì) mRNA 水平 (B) 和 ALDH1A3 表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析 (C)。(D) 每天 IDA (50 mg/kg) 的 nu/nu 小鼠中 HT29 WT 和 ALDH1A3 KO 異種移植物的腫瘤圖像。(E) 人類 ALDH1A3 基因啟動(dòng)子區(qū)域的示意圖，存在三個(gè)潛在的結(jié)合區(qū) (R1-R3)，其中 R3 包含相同的序列。(F) 通過酶測定在 HT29 WT 和 ALDH1A3 KO 細(xì)胞中測量的 NADH 水平。(G) 補(bǔ)充 DMSO 或 NADH (10 μM) 后，用 RSL3 (5 μM) 處理的 HT29 ALDH1A3 KO 細(xì)胞死亡。(H) HT29 WT、ALDH1A3 KO 和 FSP1 KO 細(xì)胞中還原 CoQ10 與氧化 CoQ10 的相對(duì)比率。

此外，差異基因的基因本體 (GO) 分析發(fā)現(xiàn)，NADH 脫氫酶（醌/泛醌）活性的途徑在 IDA 處理的細(xì)胞中特異性富集，這意味著 IDA-AHR 軸可能通過 NADH 介導(dǎo)的輔酶 Q10 還原促進(jìn) FSP1 調(diào)節(jié)的抗鐵死亡作用。

體外實(shí)驗(yàn)表明純化的 ALDH1A3 可以通過視黃醛產(chǎn)生 NADH。ALDH1A3 缺失顯著降低了 NADH 水平，而在 ALDH1A3 KO 細(xì)胞中補(bǔ)充 NADH 可恢復(fù)鐵死亡 (圖4F-G)。在 ALDH1A3−/−。和 FSP1−/−細(xì)胞中還檢測到較低比例的還原為氧化的CoQ10 (圖 4H)。總之，這些數(shù)據(jù)表明 ALDH1A3 對(duì)于 IDA-AHR-FSP1-CoQ10 介導(dǎo)的鐵死亡抑制至關(guān)重要。

本文介紹了腸道微生物代謝物 IDA 通過抑制鐵死亡促進(jìn) CRC 的發(fā)展，機(jī)制上，IDA 作為 AHR 的內(nèi)源性配體，在轉(zhuǎn)錄上上調(diào) ALDH1A3 的表達(dá)，ALDH1A3 利用視黃醛作為底物產(chǎn)生 NAD，而 NADH 對(duì)于 FSP1 介導(dǎo)的還原性輔酶 Q10 合成至關(guān)重要。在體外和體內(nèi)，AHR 或 ALDH1A3 的缺失在很大程度上消除了 IDA 促進(jìn)的腫瘤發(fā)展�？傊�，研究結(jié)果表明，靶向 IDA-AHR-ALDH1A3 軸有望用于鐵死亡相關(guān)的 CRC 治療。