文章速遞：仿生蛋白脂囊恢復陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿GPI缺乏癥

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iScience雜志（影響因子5.08）

《Biomimetic proteolipid vesicles for reverting GPI deficiency in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria》
這項研究旨在探索一種新的納米囊泡載體，使用微流體技術將人體膜蛋白與合成磷脂在Y型芯片上制備為新型仿生蛋白膜囊泡（BPLVs），用于在恢復陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PHN））患者特定細胞中釋放缺失的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白。研究結果表明，BPLVs可成功地遞送GPI-錨定蛋白到缺失的PNH細胞中，并且這些細胞對補體介導的溶解表現(xiàn)出增強的抵抗力。通過使用PE-rhodamine標記的BPLVs，研究人員觀察到紅細胞和外周血單核細胞（PBMCs）對BPLVs的優(yōu)異攝取能力，且PBMCs顯示出更強的攝取能力。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，BPLVs可提高細胞對補體介導溶解的抵抗力，尤其是PNH細胞。總體而言，這項研究為治療PNH相關癥狀提供了一種創(chuàng)新的方法，BPLV 可作為有效的納米載體，將蛋白質轉移到目標細胞，以恢復PNH病的蛋白質缺乏。

（技術線路圖）

脂質納米顆粒是藥物遞送的新領域，因為它們成功地克服了藥物遞送的常見問題，如生物利用度低、半衰期短、藥物不穩(wěn)定、可能產生副作用以及缺乏靶向遞送等。脂質納米顆粒可采用不同的技術制造，如薄膜水合、超臨界流體工藝或微流體方法。在微流控方案中，乙醇和水相會在微通道內混合，如果工藝參數(shù)（如流速和流速比）優(yōu)化得當，就能獲得單層單分散納米顆粒。與其他技術相比，微流控方法還具有放大可行性、更高的封裝效率和出色的批次間可重復性，以及長期懸浮的穩(wěn)定性。脂質納米載體通常顯示出較低的全身毒性，可用于配制注射系統(tǒng)，這一點已在幾種封裝藥物的商業(yè)制劑中得到證實，如抗腫瘤分子、抗生素、抗真菌藥物或麻醉劑，以及核酸或 mRNA 疫苗。

蛋白脂納米載體是藥物遞送領域的一項新技術，通過在合成脂質納米載體中整合白細胞衍生的膜蛋白而獲得，類似于白細胞的生理活動，如細胞粘附和炎癥調節(jié)。在體外和體內模型中，這些納米載體在減少中性粒細胞浸潤和促進炎癥消退方面具有巨大潛力。

在該文獻中，作者介紹了使用銳訊生物科技有限公司生產的NanoGenerator Flex M微流控設備和Y型芯片，配制仿生蛋白脂囊泡BPLVs，作者首先優(yōu)化了 BPLV 組裝的微流控條件，并將合成脂質和從健康供體外周血單核細胞（PBMC）獲得的膜蛋白混合在一起。隨后，我們對功能化 BPLV 的大小、形態(tài)、表面電荷和細胞毒性進行了表征，并在健康和病理人類原代細胞上對其治療 PNH 的潛力進行了體外測試。

（仿生蛋白脂囊（BPLV）的表征）

BPLV 的物理表征方法是：

（A）動態(tài)光散射（DLS）分析，顯示出具有負 zeta 電位的均勻群體（多分散指數(shù)，PDI），這是細胞膜相互作用的最佳狀態(tài)；

（B）Nanosight 確認了顆粒大小的均勻分布，并獲得了顆粒濃度。數(shù)據以平均值 G 標準差 (SD) 表示。

  (C)  透射電子顯微鏡還研究了 BPLV 的形態(tài)，并使用磷鎢酸溶液（2% w/v）對脂質層進行染色，從而觀察到空的 BPLV（左圖）和負載的 BPLV（右圖）中的單脂質層。

流式細胞術研究了 BPLV 的表面蛋白表達，首先根據同時存在的羅丹明標記磷脂和人類膜蛋白（CD3）對顆粒進行了鑒定。計算了這些顆粒上 Flaer+ 、CD33+ 、CD14+ 、CD45+ 和 HLA-DR+ 囊泡的百分比，并通過除以染色樣本的 MFI/未染色對照的 MFI，計算了中位熒光強度（MFI）倍數(shù)變化。

銳訊NanoGenerator Flex M微流控系統(tǒng)配備了一個內徑為 600 毫米（總長度為 10 毫米）的 Y 型交錯人字形微攪拌器芯片，流速設定為 4 mL/min，乙醇中的總脂質濃度為 17.5 mg/mL（乙醇/水相比例為 1:2），最終脂質與蛋白質的比例為 1:35。具體而言，有機相由 1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DOPC）和膽固醇組成。在脂質混合物中加入標記的 PE-羅丹明（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-利薩明羅丹明 B 磺酰）作為 BPLV 紅色示蹤劑，濃度為脂質相總量的 0.5%。水相加有從健康和 PNH PBMCs 提取的膜蛋白總提取物。然后將試劑裝入 15 mL 試管并連接到微流控電路，直接施加預設壓力，以 4 mL/min 的總恒定流速將溶液推入混合芯片。然后，將混合溶液收集到端接芯片的 15 mL 清潔試管中。作者測試了低于或高于 4 mL/min 的流速，但得到的囊泡粒徑分布更大。作者選擇的蛋白質與脂質的比例（1:35）確保了極佳的蛋白質負載。因此，他們的配方顯示出巨大的放大潛力，同時具有良好的負載和產品穩(wěn)定性，這對大規(guī)模體外和體內研究極為重要。

（紅細胞（RBC）對仿生蛋白脂囊（BPLV）的吸收）

通過共聚焦顯微鏡研究了囊泡的吸收情況，BPLV 被標記為 PE 羅丹明示蹤劑（紅色信號），而 RBC 膜則被標記為親脂性染料（DiO 親脂性示蹤劑，綠色信號）。吸收了 BPLV 的紅細胞顯示出強烈的紅色或合并的橙色信號。

(A) 親脂性示蹤劑 DiO 染色 RBC 膜（綠色信號），吸收了 PE 羅丹明 BPLV 的 RBC 顯示紅色或橙色（合并）信號。更高倍放大（10 倍變焦）的 RBC，用于 BPLV 吸收的 PE 通道（B）、用于膜染色的 FITC 通道（D）和合并通道（C）。

PNH是BMF綜合征中的一種良性克隆性血液病，是由參與GPI錨生物合成的PIGA基因發(fā)生體細胞突變引起的，其特征是需要GPI錨才能正確定位在細胞表面的蛋白質（包括內源性補體調節(jié)蛋白CD55和CD59）無法在膜上錨定。PNH 的癥狀繼發(fā)于補體誘導的細胞溶解，如血管內紅細胞溶解和血栓形成，從而導致貧血和血栓事件。血栓形成是 PNH 患者死亡的主要原因，占死亡人數(shù)的 40% 以上，可發(fā)生在任何部位，最常見的是肝靜脈（Budd-Chiari 綜合征，占患者的 7.5-25%）和腦靜脈。PNH 癥狀可通過補體抑制劑進行藥物治療，以減少補體對 GPI 缺乏細胞的激活，從而改善其存活率。然而，PNH 克隆會積聚到外周血中，并在補體最大激活時（如細菌感染時）被溶解，從而超過補體抑制作用，導致突破性溶血，尤其是在新型補體抑制劑（如 ravulizu- mab）治療下。因此，需要采用不同的藥理學方法來改善 PNH 患者的臨床治療。在這項研究中，作者配制了攜帶 GPI-錨地定蛋白的 BPLVs，用于一種創(chuàng)新的治療方法，以獲得一種新的蛋白質遞送系統(tǒng)來恢復 PNH 細胞的 GPI 缺乏。

本文提供了一種治療 PNH 相關癥狀的創(chuàng)新方法，即用由人類膜蛋白和合成磷脂組成的BPLVs作為蛋白質遞送系統(tǒng)，在不改變細胞基因組的情況下向 PNH 細胞釋放整套 GPI-anchored 蛋白質。這種方法是 PNH 領域的一項創(chuàng)新，這種利用微流體技術將復雜蛋白質提取物加入脂質囊泡而制成的蛋白質遞送平臺已被用于向 PNH 細胞遞送缺乏的蛋白質。制備的囊泡是仿生的，沒有毒性，與細胞膜的親和力極強，因此能很好地吸收和輸送蛋白質，從而有效地恢復 PNH 克隆細胞的蛋白質缺乏癥。這項研究成果開辟了新的治療方案，因為細胞表型的改變無需引入 DNA 的變化，從而克服了與使用病毒載體或其他基因組修飾劑有關的所有技術問題。這些改變很可能是短暫的，因為它們依賴于細胞的壽命，沒有在細胞基因組中引入永久性改變。這可能是一個不利因素，因為患者可能需要長時間的治療；反之，通過劑量和時間調節(jié)，與治療相關的不良反應可能會得到更好的控制。這個系統(tǒng)還可進一步用于在納米載體中加入嵌合受體或其他重組蛋白，以實現(xiàn)先進的給藥功能，治療由特定蛋白缺乏引起的各種疾病。盡管研究結果非常令人鼓舞，但還需要在更多的體外和體內研究中進一步驗證。


原文：https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109021