細(xì)胞消化酶的類(lèi)型及對(duì)細(xì)胞作用的影響因素分析

一、胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱(chēng)胰酶)

是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi)，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類(lèi)型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。

細(xì)胞類(lèi)型

胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織，如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效，但若與膠原酶合用，就能增加其對(duì)組織的分離作用。

酶的活力

市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過(guò)測(cè)定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì)影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，最終使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時(shí)活力最強(qiáng)。

該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過(guò)高，保存時(shí)間不能太長(zhǎng)，若粉劑結(jié)團(tuán)塊，說(shuō)明該部分受潮或失效。

酶的濃度

胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)，但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

溫度

一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性最強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。

pH

pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.6~8.0之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷。

無(wú)機(jī)鹽離子

若用含有鈣和鎂的鹽類(lèi)溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制時(shí)應(yīng)采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制。

消化時(shí)間

如果細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4℃過(guò)夜也可。

二、膠原蛋白水解酶(簡(jiǎn)稱(chēng)膠原酶，Collagenase)

它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶的化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，因此，這對(duì)溫度、PH和導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構(gòu)象和性質(zhì)。
 

膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內(nèi)源性膠原酶和藥用膠原酶兩種。其中用于原代細(xì)胞分離的是藥用膠原酶（collagenase），它是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%
 

膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專(zhuān)用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類(lèi)型選擇膠原酶類(lèi)型。
 

1、膠原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。用于消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì) 胞，用于哺乳動(dòng)細(xì)胞的分離�！　�

2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織　　

3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞。　　

4、膠原酶Ⅱ適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

胰蛋白酶應(yīng)用廣泛，特異性也差，一般用在間質(zhì)少的細(xì)胞組織；中性蛋白酶作用相對(duì)特異性，常用于皮膚組織細(xì)胞的分離，比胰蛋白酶也要溫和點(diǎn)。以皮膚為例，胰蛋白酶既破壞橋粒也破壞半橋粒，其作用部位是基底層細(xì)胞和其上的棘層細(xì)胞，而中性蛋白酶只破壞半橋粒，不影響表皮細(xì)胞之間的連接，作用部位在基底膜Iv型膠原和纖維粘連蛋白。