PEAKS QC功能和蛋白變化趨勢(shì)設(shè)計(jì)結(jié)合實(shí)現(xiàn)最準(zhǔn)確的TMT定量詳解
PEAKS系列講座火熱報(bào)名中�。。�
最后一講將于3月13日（周三）上午10:00準(zhǔn)時(shí)開(kāi)啟，由BSI產(chǎn)品經(jīng)理李文婷分享“質(zhì)譜數(shù)據(jù)定性、定量分析的全自動(dòng)化與質(zhì)量控制”的主題報(bào)告，點(diǎn)擊“活動(dòng)丨PEAKS系列講座--蛋白組研究熱點(diǎn)應(yīng)用”，即可快速報(bào)名。
本論文的數(shù)據(jù)分析工作由Bioinformatics Solutions Inc.PEAKS Studio團(tuán)隊(duì)協(xié)助完成，成果已發(fā)表于J. Am. Soc. Mass Spectrom[1]。
取4份野生型小鼠腦組織蛋白酶切肽段，按照0.81:1:1:0.81比例分別標(biāo)記TMT10plex的127N、128N、129N和130N，所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用PEAKS Studio完成分析，PSM和Protein group的FDR均設(shè)置為1%，共得到75997 PSMs，46313 peptides，6776 protein groups，7477 proteins。同時(shí)，用PEAKS獨(dú)有的Quality Control功能可以計(jì)算每一個(gè)PSM的CV值，結(jié)果如圖1和表1，表明在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，樣本量越低，越容易產(chǎn)生更高的CVs。
圖1 兩組QC-plex的CV值分布
表1 不同QC設(shè)置的定量蛋白統(tǒng)計(jì)
在PEAKS軟件的TMT方法設(shè)置界面，可以添加Quality Control Replicate Channels，默認(rèn)CV范圍為≤30%（圖2）。圖3A-D中，紫色區(qū)域表示定量的假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)比四種QC的設(shè)置方式可以看出，QC-plex越多，假陽(yáng)性的定量就越少。
圖2 PEAKS設(shè)置TMT Quality Control
圖3 QC-plex對(duì)定量假陽(yáng)性的過(guò)濾
定量準(zhǔn)確性與CV、unique peptides數(shù)量的關(guān)系
在表2中，進(jìn)一步從unique peptide數(shù)量和CV方面比較了蛋白的定量準(zhǔn)確性。當(dāng)不使用QC-plex時(shí)，定量假陽(yáng)性（Q<0.57 or >1.05）的蛋白有89個(gè)，分別設(shè)置QC-0.81、QC-1和QC-0.81&1后，定量假陽(yáng)性的蛋白分別減少為77、24和15，并且也能看出unique peptide數(shù)量越少，越容易產(chǎn)生更高的CV，在應(yīng)用了QC-plex后，即使unique peptide為1的蛋白，CV值也都在30%以下。
表2 不同QC設(shè)置的蛋白數(shù)統(tǒng)計(jì)
蛋白趨勢(shì)變化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
雖然上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PEAKS QC功能對(duì)豐度較低且unique peptide數(shù)量少的蛋白定量的校正效果，但實(shí)際上，我們很難改變復(fù)雜生物學(xué)樣本中提取出來(lái)的蛋白豐度，因此本研究又設(shè)計(jì)了圖4所示的趨勢(shì)變化實(shí)驗(yàn)（Trend design）的方案，從另一個(gè)角度實(shí)現(xiàn)TMT定量準(zhǔn)確性的判斷。該方案共包含5組小鼠：野生型小鼠組（WT）、無(wú)處理基因敲除小鼠組（non-Treated）、低劑量低親和力分子處理基因敲除小鼠組（LowAffinity_LowDose）、低劑量高親和力分子處理基因敲除小鼠組（HighAffinity_LowDose）、高劑量高親和力分子處理基因敲除小鼠組（HighAffinity_HighDose），每組肽段使用不同channel的TMT試劑標(biāo)記，然后等量混合進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
圖4 不同分子親和力富集及劑量差異設(shè)計(jì)
圖5 不同處理組之間蛋白表達(dá)量的倍數(shù)變化
影響蛋白定量準(zhǔn)確性的兩個(gè)主要因素，一個(gè)是豐度低，一個(gè)是unique peptide數(shù)量過(guò)少，但我們并不能改變未知樣品中存在的這兩個(gè)客觀(guān)問(wèn)題，因此建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡可能多做一些重復(fù)，通過(guò)QC-plex來(lái)計(jì)算CV，從而檢驗(yàn)重現(xiàn)性。此外，結(jié)合Trend-design，可以達(dá)到最準(zhǔn)確的TMT定量效果（圖6）。
1. Xianyin Lai, Guihong Qi, Chris Kovach, Yaming Wang, Isaiah Clark, Keyue Chen, Zhixiang Yang, Nick Babb, Forest Andrews, Ross Fellows, Baozhen Shan, Weiwu Chen, Tom Yang, and Wenting Li. Journal of the American Society for Mass Spectrometry . DOI: 10.1021/jasms.3c00346.
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