Myh11-CreERT2-RAD小鼠在平滑肌細(xì)胞研究中的重要應(yīng)用

平滑肌細(xì)胞（SMC, Smooth Muscle Cell）組成了血管和內(nèi)臟器官的肌肉層，在損傷、炎癥或高膽固醇血癥的情況下，血管SMC可以“去分化”和增殖，若不加以控制，會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生、動(dòng)脈粥樣硬化及其他病變。

由于去分化的SMC會(huì)嚴(yán)重下調(diào)特異性收縮蛋白的表達(dá)，因此在譜系追蹤方法出現(xiàn)之前，SMC在心血管疾病中的作用一直被低估。人們利用Cre-loxP重組系統(tǒng)對(duì)成熟的SMC進(jìn)行標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)分化的SMC可產(chǎn)生多種細(xì)胞，類似巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。這些結(jié)果從根本上改變了SMC的研究。

Myh11-CreER^T2-Off小鼠品系被認(rèn)為是SMC研究中的金標(biāo)準(zhǔn)，目前已廣泛用于條件突變或譜系追蹤實(shí)驗(yàn)。這個(gè)品系在血管和內(nèi)臟SMC中發(fā)生特異性重組，表明編碼平滑肌肌球蛋白重鏈的MYH11仍是分化SMC的最具特異性標(biāo)志物。不過，遺憾的是，這種基于細(xì)菌人工染色體（BAC, bacterial artificial chromosome）的小鼠品系插入位置位于Y染色體中，因此無法對(duì)雌性小鼠進(jìn)行分析。

為此，弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu)的研究人員構(gòu)建了一種新的小鼠品系Myh11-CreER^T2-RAD。他們?cè)谛∈蟮?號(hào)染色體上插入BAC，因此可以在雄性和雌性小鼠上開展譜系追蹤和基因敲除研究。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》雜志上。
 

圖片來源：《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》
（https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.122.318160）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員對(duì)BAC克隆RP23-151J22進(jìn)行改造，在Myh11基因的起始密碼子后插入Cre-ER^T2表達(dá)框，產(chǎn)生了Myh11-CreER^T2-RAD轉(zhuǎn)基因小鼠品系（由賽業(yè)生物提供）。他們將Myh11-CreER^T2-RAD小鼠與兩種不同的熒光報(bào)告基因小鼠雜交，并通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析檢測(cè)了SMC的特異性標(biāo)記。

技術(shù)路線
01 對(duì)細(xì)菌人工染色體進(jìn)行改造，構(gòu)建Myh11-CreER^T2-RAD小鼠
02 通過報(bào)告基因表達(dá)比較Myh11-CreER^T2-RAD與Myh11-CreER^T2-Off的活性
03 評(píng)估Myh11-CreER^T2-RAD轉(zhuǎn)基因驅(qū)動(dòng)的Cre表達(dá)是否具有SMC特異性
04 評(píng)估Myh11-CreER^T2-RAD小鼠在缺乏tamoxifen下的報(bào)告基因表達(dá)

研究結(jié)果
1 構(gòu)建Myh11-CreER^T2-RAD小鼠
研究人員首先對(duì)BAC克隆進(jìn)行改造，在小鼠Myh11基因的起始密碼子后插入Cre-ER^T2表達(dá)框，并去除BAC載體骨架上的loxP和loxP511位點(diǎn)。之后將改造后的BAC注射到C57BL/6小鼠受精卵的原核中，使其隨機(jī)插入基因組。然后將受精卵植入代孕母親體內(nèi)，獲得攜帶轉(zhuǎn)基因的后代。Myh11-CreER^T2-RAD小鼠的構(gòu)建工作由賽業(yè)生物完成。為了確定Myh11-CreER^T2-RAD轉(zhuǎn)基因的染色體插入位點(diǎn)，他們進(jìn)行了靶向位點(diǎn)擴(kuò)增分析和新一代測(cè)序，顯示轉(zhuǎn)基因整合在2號(hào)染色體上。

2 與Myh11-CreER^T2-Off小鼠的比較
為了比較Myh11-CreER^T2-RAD與Myh11-CreER^T2-Off的活性，研究人員將小鼠與tdTom或eYFP熒光報(bào)告基因小鼠雜交，并在小鼠口服tamoxifen后通過共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估熒光蛋白表達(dá)（圖1）。他們發(fā)現(xiàn)，口服tamoxifen可以誘導(dǎo)Cre+小鼠頭臂動(dòng)脈的SMC表達(dá)tdTom或eYFP。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，頭臂動(dòng)脈中95%的SMC表達(dá)tdTom。

通過熒光蛋白分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Myh11-CreER^T2-RAD和Myh11-CreER^T2-Off小鼠的報(bào)告基因表達(dá)差異小于10%。重要的是，管腔內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞或外彈力板的外膜細(xì)胞沒有檢測(cè)到標(biāo)志物。按性別來看，雄性和雌性Myh11-CreER^T2-RAD小鼠的報(bào)告基因表達(dá)無顯著差異。這些結(jié)果表明，Myh11-CreER^T2-RAD轉(zhuǎn)基因驅(qū)動(dòng)了動(dòng)脈中SMC的報(bào)告基因重組，并且與雄性Myh11-CreER^T2-Off小鼠相當(dāng)。
 

Myh11-CreER^T2-RAD有效誘導(dǎo)了floxed tdTom報(bào)告基因重組^[1]

3 熒光蛋白表達(dá)具有SMC特異性
為了確定Myh11-CreER^T2-RAD轉(zhuǎn)基因驅(qū)動(dòng)的Cre表達(dá)是否具有SMC特異性，研究人員通過免疫熒光共聚焦顯微鏡檢查了各種組織中的tdTom表達(dá)。他們?cè)谛呐K的冠狀血管中觀察到tdTom表達(dá)，并在肺動(dòng)脈和肺周細(xì)胞以及視網(wǎng)膜和斜方肌的小血管和周細(xì)胞中檢測(cè)到tdTom表達(dá)。通過這些數(shù)據(jù)，他們認(rèn)為Myh11-CreER^T2-RAD轉(zhuǎn)基因在血管和內(nèi)臟SMC及周細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)Cre重組的方式與Myh11-CreER^T2-Off類似。

4 轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出不依賴tamoxifen的報(bào)告基因重組
之前有報(bào)道稱，許多CreER^T2小鼠品系表現(xiàn)出不依賴tamoxifen的重組。為了確定Myh11-CreER^T2-RAD或Myh11-CreER^T2-Off小鼠是否會(huì)出現(xiàn)這種情況，研究人員檢測(cè)了未口服tamoxifen的轉(zhuǎn)基因小鼠中的tdTom或eYFP表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，在缺乏tamoxifen的情況下，兩種轉(zhuǎn)基因小鼠均零星表達(dá)了tdTom，但eYFP表達(dá)未檢測(cè)到（圖2）。

他們推測(cè)，tdTom報(bào)告基因的重組閾值較低，因此與包括eYFP在內(nèi)的其他報(bào)告基因相比，特別容易受到CreER^T2本底重組的影響。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，這種重組是SMC特異性的，只有在Myh11-CreER^T2-RAD或Myh11-CreER^T2-Off轉(zhuǎn)基因存在時(shí)才會(huì)發(fā)生，原因可能是一部分的CreER^T2蛋白在沒有tamoxifen的情況下被轉(zhuǎn)運(yùn)到了細(xì)胞核。這種滲漏取決于floxed基因的重組閾值，需要對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估。
 

Myh11-CreER^T2-RAD和Myh11-CreER^T2-Off可誘導(dǎo)不依賴tamoxifen的報(bào)告基因重組^[1]

研究結(jié)論
總的來說，這項(xiàng)研究構(gòu)建并驗(yàn)證了一種新的常染色體Myh11 Cre驅(qū)動(dòng)的小鼠Myh11-CreER^T2-RAD。它的性能與Myh11-CreER^T2-Off小鼠類似，但優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)研究雄性和雌性小鼠。這種小鼠品系是一種有價(jià)值的新工具，有助于發(fā)現(xiàn)健康和疾病狀態(tài)下SMC功能的性別差異。

原文檢索：
[1]Deaton RA, Bulut G, Serbulea V, et al. A New Autosomal Myh11-CreERT2 Smooth Muscle Cell Lineage Tracing and Gene Knockout Mouse Model-Brief Report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Feb;43(2):203-211. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318160.
 

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Myh11 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Myh11^em1Cflox/Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-17880-Myh11-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-03854
應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),心血管,免疫,遺傳,血液,癌癥,骨骼
打靶方案：