文獻解讀：cGAS環(huán)肽抑制劑助力靶向蛋白-DNA相互作用與液液相分離

cGAS-STING信號通路是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。cGAS作為異常胞漿DNA的重要傳感器，在病原體入侵和細胞應(yīng)激時被活化并進一步激活下游銜接蛋白STING（干擾素基因刺激因子），進而啟動先天免疫反應(yīng)。cGAS通過誘導干擾素刺激基因（ISG）的表達，在抗病毒反應(yīng)和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。相反，cGAS-STING通路的異常激活已被證明是自身免疫性和自身炎癥性疾病的關(guān)鍵發(fā)病機制。TREX1是負責降解胞質(zhì)DNA的核酸外切酶，其功能缺失突變導致胞質(zhì)dsDNA的積累和cGAS-STING途徑的異常激活，隨后引發(fā)自身免疫性疾病如Aicardi-Goutières綜合征（AGS）或凍瘡性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）。此外，各種細胞損傷引起的線粒體DNA應(yīng)激也通過觸發(fā)cGAS活性促進炎癥反應(yīng)。cGAS在先天免疫和自身炎癥反應(yīng)中的重要作用支持cGAS作為cGAS活性異常相關(guān)疾病的潛在藥物靶點。

近年來，人們致力于開發(fā)強效和特異性cGAS抑制劑，靶向cGAS活性位點的多種化學支架的cGAS抑制劑已通過高通量篩選試驗發(fā)現(xiàn)，并通過藥物化學進行了優(yōu)化。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)配體結(jié)合口袋不同，蛋白質(zhì)-DNA界面的溶劑暴露、高正電荷和平坦的特性使開發(fā)具有類藥物性質(zhì)的小分子抑制劑充滿挑戰(zhàn)性。大環(huán)肽已被證明是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs，開發(fā)小分子抑制劑的具有挑戰(zhàn)性的界面）的有效工具，因為它們具有高效力和選擇性，因此大環(huán)肽成為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-DNA界面的潛在骨架。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://www.nature.com/articles/s41467-023-41892-5）

2023年10月2日，北京大學全軍民教授團隊聯(lián)合中山大學卜憲章教授團隊在Nature Communications在線發(fā)表了題為“Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation”的研究論文，這項研究通過靶向PPIs（蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用）環(huán)肽庫的體外篩選，鑒定出一類新型cGAS環(huán)肽抑制劑。聯(lián)合團隊通過分子模擬、體外生化實驗以及細胞實驗驗證了該抑制劑靶向cGAS和dsDNA之間的蛋白質(zhì)-DNA界面，破壞dsDNA和cGAS之間的相互作用，進一步抑制dsDNA誘導的cGAS液液相分離（LLPS）。同時，優(yōu)化的類似物XQ2B在體外和體內(nèi)抑制了單純皰疹病毒-1（HSV-1）誘導的抗病毒免疫反應(yīng)，并增強了HSV-1感染。此外，XQ2B顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子水平的升高以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。這項工作為突破現(xiàn)有cGAS抑制劑臨床應(yīng)用的局限性提供了新的思路，也為自身免疫及自身炎癥性疾病的治療提供新的策略。

研究材料
在這項研究中，研究人員利用Trex1敲除小鼠構(gòu)建自身免疫性疾病模型（由賽業(yè)生物提供，產(chǎn)品編號：S-KO-05559）。體外研究則采用了THP1細胞以及人原代PBMCs細胞和相關(guān)鼠源細胞，并提取了Trex1敲除小鼠的骨髓來源的巨噬細胞。

研究方法
作者采用了多種實驗技術(shù)，包括各種組織學染色、WB、qPCR、熒光偏振、微量熱泳動、表面等離子共振、流式細胞術(shù)、免疫熒光、ELISA等。

技術(shù)路線
01 從體外大環(huán)肽庫中篩選cGAS抑制劑
02 通過人源和鼠源細胞中驗證了環(huán)肽化合物的cGAS抑制效力和特異性
03 體外驗證了環(huán)肽化合物與cGAS結(jié)合作用機制
04 體外驗證了環(huán)肽化合物抑制DNA誘導的cGAS液相縮合
05 體外和體內(nèi)水平驗證了環(huán)肽化合物減弱宿主的抗病毒防御
06 在自身免疫疾病模型小鼠——Trex1^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）中，驗證了環(huán)肽化合物減輕了小鼠的全身炎癥

研究結(jié)果

XQ2與cGAS結(jié)合并阻斷cGAS-DNA相互作用[1]

為了從大環(huán)肽庫中篩選靶向蛋白質(zhì)-DNA界面的cGAS抑制劑，作者應(yīng)用了一種基于RNA的熒光生物傳感器來檢測2',3'-cGAMP，用于體外篩選cGAS活性抑制劑，并通過細胞實驗進一步篩選驗證。在體外蛋白水平和細胞水平測定中苗頭分子（hits）之間的抑制活性差異可能歸因于它們不同的細胞滲透性，作者鑒定出XQ2在細胞測定中具有最佳cGAS抑制活性，并進一步驗證了XQ2特異性抑制人源和鼠源細胞中dsDNA誘導的cGAS活化和cGAS-STING信號傳導。

接下來，作者在體外通過表面等離子體共振（SPR）、微量熱泳動（MST）以及熒光偏振（FP）等技術(shù)分析表明XQ2與cGAS直接結(jié)合，并阻斷cGAS與DNA的相互作用。值得關(guān)注的是研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)高濃度的ATP/GTP顯著促進XQ2與cGAS的結(jié)合親和力（K_d=4.5±1.6 μM vs K_d=45.3±26.9 μM），該作用模式與目前報道的cGAS抑制劑活性因胞內(nèi)ATP/GTP競爭而減弱顯然不同。作者進一步結(jié)合分子對接及定點突變闡明XQ2與cGAS的潛在結(jié)合模式。
 

XQ2抑制DNA誘導的cGAS液液相分離[1]

DNA誘導的cGAS液液相分離（LLPS）在調(diào)節(jié)酶活性和先天免疫信號傳導中起著至關(guān)重要的作用。鑒于XQ2對dsDNA與cGAS結(jié)合的抑制作用，作者進一步在體外蛋白水平和細胞水平驗證了XQ2以劑量依賴的方式有效抑制DNA誘導的cGAS液液相分離。
 

XQ2B抑制Trex1^-/-小鼠的全身炎癥[1]

為了評估XQ2B的臨床應(yīng)用價值，作者利用自身免疫性疾病模型——Trex1^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供），進一步驗證了XQ2B顯著抑制了Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子的表達水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，表明XQ2B有效地減輕了Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，突出了靶向蛋白質(zhì)-DNA界面的cGAS特異性抑制劑在cGAS相關(guān)自身免疫性疾病中的治療潛力。

研究結(jié)論
總之，這項研究通過體外生化實驗、分子模擬、細胞實驗和動物實驗等技術(shù)手段，成功鑒定出一類全新作用機制的cGAS環(huán)肽類抑制劑，靶向蛋白質(zhì)-DNA界面，并阻斷DNA誘導的cGAS液相縮合和活化。一種優(yōu)化的類似物XQ2B在體外和體內(nèi)抑制HSV-1誘導的抗病毒免疫反應(yīng)，并顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。XQ2B作為首例靶向蛋白-DNA界面及液液相分離的特異性cGAS抑制劑，為進一步開發(fā)cGAS相關(guān)自身免疫性和自身炎癥性疾病藥物提供新的思路。

原文檢索：
[1]Wang X, Wang Y, Cao A, Luo Q, Chen D, Zhao W, Xu J, Li Q, Bu X, Quan J. Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation. Nat Commun. 2023 Oct 2;14(1): 6132.
 

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建

賽業(yè)生物構(gòu)建了Trex1基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！確保您在短時間內(nèi)獲得更具性價比的實驗用鼠，為您的研究加點速~
 

Trex1 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Trex1^em1/Cya
品系編號：
KOCMP-22040-Trex1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-05559
應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),骨骼,心血管,血液,生理系統(tǒng),遺傳,腎臟
打靶方案：

Trex1 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Trex1^em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-22040-Trex1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-17795
應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),骨骼,心血管,血液,生理系統(tǒng),遺傳,腎臟
打靶方案：