超微量分光光度計檢測方法研究

摘要：超微量分光光度計目前成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實驗室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。應(yīng)用液體的表面張力特性，檢測時經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑，達(dá)到快速、微量、高濃度檢測吸光度的特點。本文闡述了如何用現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對超微量分光光度計進(jìn)行檢測，并舉例說明對超微量分光光度計透射比、波長和雜散光等主要指標(biāo)檢測方法。最后對超微量分光光度計日常檢測過程中可能遇到的問題并對其進(jìn)行分析。

分光光度計是一類重要的分析儀器，無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域 ，還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門，紫外可見分光光度計都有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。由于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量樣本量很小，于是超微量分光光度計應(yīng)運(yùn)而生。

目前超微量分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器，應(yīng)用液體的表面張力特性，樣品體積只需要0.5～2μL，在檢測臺上，經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑達(dá)到快速、微量、高濃度及不用石英管、毛細(xì)管等耗材檢測吸光度的特點，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實驗室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。

超微量分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成，與傳統(tǒng)分光光度計有明顯的不同。二者有以下7點區(qū)別:
(1)所需樣品體積小，僅需0.5～2μL;
(2)不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到檢測平臺上，測量時樣品自動形成液柱，檢測完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可;
(3)一般具有1mm和0.2mm兩個光程(電機(jī)控制自動選擇)，而傳統(tǒng)分光光度計的光程為10mm，分光光度計樣品無需稀釋，測量范圍可達(dá)到常規(guī)分光光度計的50倍;
(4)氙氣閃光燈為燈源，代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見)，使用壽命更長;
(5)不需要預(yù)熱，可隨時檢測;
(6)顯示吸光度值的同時，程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);
(7)體積比傳統(tǒng)分光光度計小很多(用體積數(shù)值表述)。

超微量分光光度計與傳統(tǒng)的紫外可見分光光度計工作原理相同，都是根據(jù)物質(zhì)的分子對紫外、可見區(qū)輻射(光)的選擇性吸收和朗伯－比爾(Lambert－Beer)定律對物質(zhì)進(jìn)行定量分析和定性鑒別的儀器。
朗伯 － 比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:
A = -lg(I/I ₀ )= -lgT = klc
式中:A—物質(zhì)的吸光度;
I ₀ —入射的單色光強(qiáng)度;
I—透射的單色光強(qiáng)度;
T—物質(zhì)的透射比;
k—物質(zhì)的吸光系數(shù);
l—被分析物質(zhì)的光程;
c—物質(zhì)的濃度。
由此可見，單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光程)成正比。物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。

現(xiàn)行的紫外可見分光光度計檢定依據(jù)為 JJG178－2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》國家計量檢定規(guī)程。其中規(guī)定透射比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.06000/1000重鉻酸鉀的0.001mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測量透射比三次。重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液在相應(yīng)波長下不同溫度的透射比值如表 1 所示。


超微量分光光度計檢測方法
透射比準(zhǔn)確度和重復(fù)性的測量
分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處，將重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液［紫外分光光度計溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW(E)130066］作為樣本進(jìn)行測量。
首先，超微量紫外可見分光光度計結(jié)果為吸光度值，然而紫外分光光度計溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液)證書的特性量值用透射比表示。其次，超微量紫外可見分光光度計光徑為1mm或0.2mm，和紫外分光光度計溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)內(nèi)徑為10nm的標(biāo)準(zhǔn)石英吸收池定值條件并不一致。這樣就需要對所測出的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
由朗伯－比爾定律 A = klc可知，被測物質(zhì)的光程和吸光度值成正比，可將超微量分光光度計波長為313nm時，光徑為1mm 的吸光度值0. 030，擴(kuò)大10倍，轉(zhuǎn)化成光徑為10mm的吸光度值為0.300。同理，光徑為 0. 2mm的吸光度值0. 006，擴(kuò)大50倍，轉(zhuǎn)化成光徑10mm的吸光度值也為0.300。又根據(jù)朗伯－比爾定律 A =-lgT，可得 T =10-A 。超微量分光光度計波長為 313nm 時，T =10-0. 300=50. 1%。
依據(jù) JJG178－2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》國家計量檢定規(guī)程要求，分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測量透射比三次。透射比最大允許誤差≤ ±2. 0%，透射比重復(fù)性≤1. 0%，符合Ⅳ級儀器指標(biāo)要求。

波長準(zhǔn)確度的測量
掃描氧化鈥的光譜曲線，依次查找 200nm～900nm 的指定波長，配合圖譜下方的數(shù)據(jù)列表，找出氧化鈥光譜曲線的波峰值(與其對應(yīng)的則是光譜曲線透射比的波谷值)。
依據(jù) JJG178－2007 規(guī)程的計量性能要求，波長在200nm～340nm 區(qū)段，最大允許誤差≤±2nm，波長在340nm～900nm 區(qū)段，最大允許誤差≤± 4nm，波長重復(fù)性≤1nm，符合Ⅳ級儀器指標(biāo)要求。

雜散光的測量
測量生化分析儀校準(zhǔn)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(BW2025)中的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(注:溶液濃度為 50g/L) 根據(jù)朗伯 － 比爾定律，先將儀器測量的吸光度值轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm 的吸光度值:A 10nm =10A 1nm = 1. 412×10 =14. 12。超微量分光光度計波長為 340nm 時雜散光的結(jié)果，轉(zhuǎn)化成 T =10^－A=10^{－14. 12}=0. 0%。依據(jù) JJG178 －2007 規(guī)程的計量性能要求，儀器雜散光(透射比)≤0. 1%，符合Ⅰ級儀器指標(biāo)要求。

常見超微量分光光度計檢測中的問題及分析
超微量分光光度計的零點漂移
用紫外分光光度計標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液)檢測儀器透射比準(zhǔn)確度，分別設(shè)置235nm、257nm、313nm、350nm 四點波長，以空白溶液為參比，在對應(yīng)波長下調(diào)零后，用紫外分光標(biāo)準(zhǔn)溶液測量被測儀器的透射比。
測量結(jié)果與紫外可見分光光度計標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)透射比差別較大，且連續(xù)測量3次，對測量結(jié)果的影響不大。
經(jīng)過測量結(jié)果數(shù)據(jù)分析，儀器經(jīng)轉(zhuǎn)化后的透射比結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)值小，得出吸光度值原始測量結(jié)果則比吸光度的標(biāo)準(zhǔn)值大，其中發(fā)現(xiàn)吸光度的誤差變化成線性，且誤差均是 0.10。
這樣將標(biāo)準(zhǔn)空白溶液當(dāng)成樣本，測量空白溶液吸光度值，發(fā)現(xiàn)空白溶液的吸光度值為 0. 010(被測儀器的光徑為1mm)。轉(zhuǎn)化成光徑為10mm 的吸光度對應(yīng)正好也就相差 0.10。這種方法可以測量出該儀器的零點漂移。把儀器的吸光度的本底減去后符合朗伯 － 比爾定律。

結(jié)束語
通過上述的檢測方法闡述和問題分析，對判斷超微量分光光度計的計量性能有了更加可行的手段和方法。依據(jù) JJG178 － 2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》中的要求，并沒有規(guī)定對超微量分光光度計有效的檢測方法。因此結(jié)合計量部門的實際情況，設(shè)計一套有效的檢測方法，使得計量標(biāo)準(zhǔn)得到有效的量值傳遞，也同時解決了超微量分光光度計此前無法量值溯源問題，是值得在今后的工作中加以推廣并完善的。