小鼠模型在腸道菌群調(diào)控高甘油三酯性胰腺炎進展的新機制研究中的應用

急性胰腺炎（Acute pancreatitis, AP）作為臨床常見急腹癥，病死率高達20-40%。近年來，隨著飲食組成的改變，我國高甘油三酯血癥性胰腺炎（Hypertriglyceridemic pancreatitis, HTGP）發(fā)病率呈逐年升高趨勢，以“年輕化、重癥化、易復發(fā)、并發(fā)癥多”為主要臨床特點，己超過酒精性胰腺炎成為AP的第二大類型，給臨床救治工作帶來極大困難。多項研究均已證實，HTGP伴有較高的病死率，易并發(fā)多臟器衰竭、感染性胰腺壞死等并發(fā)癥，住院時間更長，再入院率更高。探究HTGP的發(fā)病機制將有利于延緩該病進展，以期為HTGP患者提供精準化、個體化的治療策略。目前，有關(guān)HTGP發(fā)病機制研究多聚焦于脂質(zhì)代謝、局部微循環(huán)、炎癥反應及遺傳性因素等方向。雖然相關(guān)研究逐年增加，但確切機制仍未完全闡明。

腸道菌群作為機體的重要組分，參與調(diào)控代謝產(chǎn)物合成、宿主防御及免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物學過程，對維持機體穩(wěn)態(tài)與平衡有重要價值，有望成為胰腺疾病治療的新靶點。然而，腸道菌群是否調(diào)節(jié)HTGP進展缺乏充足的實驗證據(jù)，及其具體分子機制尚不清晰。

2023年10月4日，哈爾濱醫(yī)科大學孫備團隊在《Nature Communications》發(fā)表題為“Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)高甘油三酯血癥性胰腺炎（HTGP）患者腸道單形擬桿菌（B.uniformis）豐度下調(diào)，導致其代謝產(chǎn)物�；撬徇w移至胰腺內(nèi)減少，進而激活中性粒細胞內(nèi)NF-κB、IL-17信號通路及促進結(jié)腸IL-17釋放加速胰腺中性粒細胞胞外捕獲網(wǎng)形成（NETs），最終加劇HTGP胰腺損傷。本研究為腸道菌群恢復免疫動態(tài)平衡，緩解HTGP胰腺損傷提供有力證據(jù)。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://doi.org/10.1038/s41467-023-41950-y）

研究材料
在這項研究中，研究人員使用了Gpihbp1敲除小鼠（由賽業(yè)生物提供，產(chǎn)品編號：S-KO-12718）構(gòu)建了HTGP模型，以及使用了Pad4敲除小鼠（由賽業(yè)生物提供，產(chǎn)品編號：S-KO-03607）構(gòu)建了NETs缺陷模型。

研究方法
采用了多種實驗技術(shù)，包括各種組織學染色、WB、qPCR、轉(zhuǎn)錄組學測序（RNA-seq）、非靶向代謝組學、氨基酸靶向代謝組學、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、流式細胞術(shù)、免疫熒光、ELISA等。

技術(shù)路線
01 檢測高甘油三酯血癥性胰腺炎患者的腸道菌群變化情況
02 移植HTGP患者糞便顯著加重疾病嚴重程度，并發(fā)現(xiàn)特異性菌群改變（Bacteroides uniformis）與HTGP進展密切相關(guān)
03 腸道菌群衍生的�；撬峥蛇w移至胰腺直接抑制NF-κB、IL-17信號通路激活減少胰腺NETs形成
04 腸道菌群可抑制結(jié)腸Th17激活并減少IL-17通過“腸-胰軸”向胰腺釋放，緩解胰腺NETs形成

研究結(jié)果

HTGP患者中腸道菌群變化[1]

為研究HTGP患者特異性菌群差異，研究人員比較三組人群樣本腸道菌群間的菌群豐度差異。相較于健康人群（HC）組，HTGP患者腸道菌群的α多樣性顯著降低（圖1a），β多樣性顯示 HTGP、HTG及HC人群的腸道菌群組成與結(jié)構(gòu)具有顯著差異（圖1b）�；�于屬、種水平分析，研究團隊發(fā)現(xiàn)HTGP患者的腸球菌及大腸埃希菌等條件性致病菌豐度顯著上調(diào)，而 Faecalibacterium prausnitzii，F(xiàn)aecalibacterium，Bacteroides uniformis 等有益菌豐度豐度顯著下調(diào)（LDA>4, P<0.05）（圖1d-f）。其中腸道菌群與HTGP病情嚴重程度具有相關(guān)性，如：Bacteroides uniformis及Bacteroides vulgatus與系統(tǒng)性并發(fā)癥發(fā)生呈負相關(guān)（圖1g），上述結(jié)果揭示了腸道菌群標志物在HTGP診治中的臨床價值。
 

腸道菌群紊加重HTGP進展[1]

為明確是否腸道菌群變化直接導致HTGP進展，研究人員利用FMT構(gòu)建菌群人源化小鼠模型，并對FMT后各組小鼠進行病理學相關(guān)檢測。結(jié)果顯示：相較于移植健康人群組，移植HTGP患者糞便（FMT-HTGP）組小鼠的胰腺損傷程度、炎癥指標（淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-1β）水平均顯著升高（圖2a-c）。16S檢測發(fā)現(xiàn)FMT-HTGP組腸道菌群的α多樣性顯著降低（圖2d），β多樣性顯示三組腸道菌群組成與結(jié)構(gòu)具有顯著差異（圖2e）。基于種水平分析， Bacteroides uniformis同樣在FMT-HTGP組中顯著下調(diào)（P<0.05）（圖2f-g）。
 

腸道菌群通過調(diào)控胰腺NETs形成緩解HTGP進展[1]

為證明腸道菌群對HTGP胰腺組織免疫細胞的調(diào)控，流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)FMT-HTGP組小鼠胰腺中性粒細胞的募集與活化顯著增強，CD45+Ly6g+細胞比例升高（圖3a）。進一步利用免疫組化比較胰腺組織中性粒細胞的表達與分布，結(jié)果提示：Ly6g在FMT-HTGP組中表達顯著上調(diào)（圖3b）。轉(zhuǎn)錄組測序顯示差異mRNA表達數(shù)據(jù)進行功能預測分析，提示FMT-HTGP組胰腺中的白細胞活化、中性粒細胞浸潤及中性粒細胞脫顆粒等功能富集顯著上調(diào)（圖3b, d）。單細胞數(shù)據(jù)經(jīng)過t-SNE降維聚類、差異表達基因分析，研究人員通過細胞注釋獲得13類細胞（圖3e），同樣印證了中性粒細胞在FMT-HTGP組中占比明顯升高（圖3f）。Cxcl2、Il23a、Ccl6、Ccl21等介導中性粒細胞趨化的基因在FMT-HTGP組上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)介導NETs形成的關(guān)鍵基因Padi4、Cd177、MPO等在FMT-HTGP組中同樣顯著上調(diào)（圖3g）。GSEA分析提示，相較于FMT-HC組，F(xiàn)MT-HTGP組中性粒細胞的NETs通路富集評分及其激活的關(guān)鍵基因更高（圖3h, i）。提取兩組小鼠外周血中性粒細胞，細胞染色SYTOX觀察NETs形成差異，顯示FMT-HTGP組NETs形成明顯增強（圖3j），胰腺組織內(nèi)同樣證實FMT-HTGP中NETs激活明顯增強（圖3k-l）。
 

Bacteroidesuniformis通過抑制NETs形成來緩解HTGP[1]

B.uniformis在HTGP患者和FMT-HTGP組明顯降低（圖4a-b）。為探究B.uniformis是否通過中性粒細胞發(fā)揮作用，研究者進行B.uniformis灌胃而后構(gòu)建HTGP模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B.uniformis緩解HTGP胰腺損傷（圖4c），減輕HTGP炎癥反應。B.uniformis干預可緩解HTGP病程中胰腺中性粒細胞的過度募集及胰腺NETs形成（圖4d, e）。

此外，研究人員對抗生素處理后的Gpihbp1^-/-敲除鼠（賽業(yè)生物提供）構(gòu)建HTGP模型進行B.uniformis干預（圖4b），結(jié)果提示：相較于對照組小鼠，單菌干預組（B.U+HTGP）組小鼠的胰腺損傷程度、炎癥指標等均顯著降低（圖42f, g）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在Gpihbp1^-/-敲除鼠中，B.uniformis同樣有效抑制了中性粒細胞的募集與NETs的形成。CD45與Ly6g、CitH3與MPO免疫熒光雙染證實，B.U+HTGP組胰腺組織中性粒細胞的募集與NETs形成顯著減少（圖4h-k）。綜上，研究者發(fā)現(xiàn)B.uniformis可通過抑制中性粒細胞浸潤及NETs形成，進而緩解HTGP。
 

Bacteroidesuniformis衍生�；撬峥删徑釮TGP[1]

在FMT試驗中，研究人員分別對FMT-HC組與FMT-HTGP組血漿樣本進行非靶向代謝組學測定，結(jié)果提示：糞便�；撬嵩贔MT-HC組中表達水平升高（圖5a），ELISA證實代謝組學結(jié)果（圖5b），菌群-代謝相關(guān)性分析提示：B.uniformis可能通過促牛磺酸合成延緩HTGP進展（圖5c）。在單菌試驗中氨基酸靶向代謝組學測定，結(jié)果提示：糞便牛磺酸在B.U+HTGP組中表達水平升高（圖5d），ELISA檢測B.U+HTGP小鼠血漿牛磺酸水平同樣高于對照組（圖5e）。基于多組學研究結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)牛磺酸是腸道菌群緩解HTGP進展的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，隨即驗證牛磺酸在HTGP中的緩解作用（圖5f）。相較于對照組（HTGP），給予HTGP小鼠�；撬犸嬘盟�干預周后，�；撬岣深A組（Tau+HTGP）小鼠胰腺損傷明顯緩解（圖5g），中性粒細胞比例表達下調(diào)（圖5h），NETs形成顯著減少（圖5i, j）。

此外，研究人員對Gpihbp1^-/-敲除鼠同樣進行驗證，證實�；撬岣深A組（B.U+HTGP）組小鼠的胰腺損傷程度顯著降低（圖5k）,中性粒細胞比例表達下調(diào)（圖5l），NETs形成顯著減少（圖5m, n）。綜上，研究者發(fā)現(xiàn)�；撬崾荁.uniformis干預后的關(guān)鍵菌群代謝產(chǎn)物，其可能通過腸屏障進入至血循環(huán)及胰腺組織中，依賴于中性粒細胞及NETs發(fā)揮抗炎作用。
 

�；撬嵬ㄟ^抑制NETs形成緩解HTGP[1]

PAD4是NETs形成的關(guān)鍵基因，Pad4基因敲除小鼠（Pad4^-/-）是公認的NETs缺陷模型。為驗證�；撬崤cHTGP病程中NETs形成的直接相關(guān)性，研究者利用Pad4敲除小鼠（賽業(yè)生物提供）構(gòu)建HTGP模型，并分別予以�；撬峄驘o菌水分別干預，共分為HTGP、Pad4^-/-+HTGP、Tau+Pad4^-/-+HTGP三組（圖6a）。首先，研究人員發(fā)現(xiàn)抑制NETs形成可明顯緩解HTGP進展，而對于Pad4^-/-小鼠構(gòu)建的HTGP模型，�；撬岣深A并未起到明顯的緩解作用（圖6b-e）。此外，免疫熒光分析提示，Pad4^-/-+HTGP組小鼠胰腺組織及外周血中性粒細胞的活化和NETs形成顯著減輕，而對牛磺酸干預對此小鼠無明顯緩解作用（圖6f）。同樣，研究人員提取各組小鼠外周血中性粒細胞并觀察體外NETs形成印證上述結(jié)論（圖6j-i）。綜上，研究人員進一步利用了Pad4敲除鼠構(gòu)建HTGP-NETs缺陷模型，從動物水平證實�；撬釋τ贖TGP病程中NETs形成的直接抑制作用。
 

明確B.uniformis及�；撬嵩贖TGP患者中的作用[1]

基于上述研究，研究人員發(fā)現(xiàn)B.uniformis促牛磺酸合成抑制NETs形成在HTGP中的重要作用。為進一步明確上述菌群、代謝、免疫節(jié)點在HTGP診治中的重要臨床價值，研究者收集20名健康志愿者及30名HTGP患者臨床血液樣本并進行相關(guān)性分析（圖7a）。血清ELISA證實健康人群的NETs水平顯著低于HTGP患者，同時NETs水平與HTGP嚴重程度成正相關(guān)；健康人群的牛磺酸水平顯著高于HTGP患者，與NETs水平呈顯著負相關(guān)（圖7b-c），B.uniformis豐度與血清�；撬崴�平呈正相關(guān)（圖7b, d）。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，健康人群外周血中性粒細胞無明顯NETs表現(xiàn)，而HTGP患者外周血可見明顯NETs形成，提取HTGP患者外周血提取的PMN進行�；撬岣深A，發(fā)現(xiàn)HTGP+Tau組體外NETs形成明顯減少（圖7e）。此外，研究者提取小鼠外周血中性粒細胞，PMA體外誘導NETs形成，同時加入HC人群與HTGP患者血漿上清進行體外共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相較于PMA誘導NETs形成組，健康人血清干預組NETs緩解，而HTGP患者血清干預組NETs并未緩解（圖7f）。相較于PMA體外誘導NETs組，牛磺酸處理可導致中性粒細胞內(nèi)磷酸化NF-κB蛋白水平顯著降低（P<0.05），同時NF-κB和IL-17A的mRNA水平降低（圖7g-i）。綜上，研究人員從臨床樣本中證實了B.uniformis、�；撬�、NETs形成的相關(guān)性，并進一步驗證了健康人血清對NETs形成的緩解作用及牛磺酸抑制NETs形成的確切機制，發(fā)掘了B.uniformis及牛磺酸在HTGP治療中的臨床價值。

研究結(jié)論
該研究發(fā)現(xiàn)高甘油三酯血癥性胰腺炎（HTGP）患者腸道單形擬桿菌（B.uniformis）豐度下調(diào)，導致其代謝產(chǎn)物�；撬崴�平降低，進而通過激活NF-κB、IL-17信號通路及促進結(jié)腸IL-17釋放加速胰腺中性粒細胞胞外捕獲網(wǎng)形成（NETs），最終加劇HTGP胰腺損傷。

原文檢索：
[1]Li, G., Liu, L., Lu, T. et al. Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis. Nat Commun 14, 6179 (2023).
 

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建

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Gpihbp1 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Gpihbp1^em1/Cya
品系編號：
KOCMP-68453-Gpihbp1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-12718
應用方向：
代謝,內(nèi)分泌,心血管,血液,肝臟,遺傳,罕見病
 

Gpihbp1 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Gpihbp1^em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-68453-Gpihbp1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-14174
應用方向：
代謝,內(nèi)分泌,心血管,血液,肝臟,遺傳,罕見病

Padi4 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6NCya-Padi4^em1/Cya
品系編號：
KOCMP-18602-Padi4-B6N-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-03607
應用方向：
癌癥,神經(jīng)元,免疫,眼科,血液,肝臟,遺傳,罕見病
 

Padi4 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6NCya-Padi4^em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-18602-Padi4-B6N-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-04225
應用方向：
癌癥,神經(jīng)元,免疫,眼科,血液,肝臟,遺傳,罕見病