GSDMD 介導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷的分子機(jī)制和在抗腫瘤中的應(yīng)用

 細(xì)胞炎性壞死 (焦亡) 常伴隨著線(xiàn)粒體的損傷，這一切的背后到底是道德的淪喪還是……咳咳咳，這究竟是巧合還是早有預(yù)謀？讓我們隨著小 M 來(lái)探索一下其中的奧秘吧~

細(xì)胞焦亡又稱(chēng)細(xì)胞炎癥性壞死，一種程序性細(xì)胞死亡方式，由炎癥小體的活化及炎癥性半胱天冬酶的激活引起，是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗外源病原菌入侵的主要手段之一[1][2][3][4]。往期研究發(fā)現(xiàn) GSDMD/E 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡早期伴隨線(xiàn)粒體損傷發(fā)生，但其潛在機(jī)制和功能尚不清楚[5]。

近期，Miao 等人發(fā)表在 Immunity 的研究首次報(bào)道了 GSDMD 介導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷的分子機(jī)制！對(duì)細(xì)胞死亡和炎癥來(lái)說(shuō)，線(xiàn)粒體損傷是一條"不歸路"：激活的 Gasdermins 結(jié)合到線(xiàn)粒體的心磷脂，形成線(xiàn)粒體孔道，這將破壞兩個(gè)線(xiàn)粒體膜，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，氧化磷酸化的喪失，細(xì)胞毒性介質(zhì)的釋放，以及線(xiàn)粒體自噬[1]。

GSDMD 介導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷的分子機(jī)制[1]。

科學(xué)不廢話(huà)！各位看官，來(lái)一來(lái)，瞅一瞅，走過(guò)路過(guò)不要錯(cuò)過(guò)哈哈哈，讓我們一起瀏覽一下吧~~



▐ 線(xiàn)粒體受損：評(píng)估線(xiàn)粒體敏感性和膜電位
研究人員使用 LPS + Nigericin 聯(lián)合處理 THP-1 巨噬細(xì)胞，結(jié)合染料 MTDR、MTG 以及 TMRM 進(jìn)行染色，評(píng)估線(xiàn)粒體膜的電位和完整性 (圖 1A-B)。與鄰近的 SYTOX 或 PI 陰性活細(xì)胞相比，SYTOX 或 PI 陽(yáng)性的焦亡細(xì)胞的 MTDR 和 TMRM 熒光明顯減弱，而 MTG 染色持續(xù)存在，表明線(xiàn)粒體在焦亡過(guò)程中去極化。

圖 1. 細(xì)胞焦亡對(duì)線(xiàn)粒體損傷的影響^[1]。

(A) 用 MitoTracker 深紅 (MTDR)、MitoTracker 綠 (MTG) 和 PI 染色的 LPS + Nigericin 處理的 THP1 的共聚焦熒光活細(xì)胞圖像。白色箭頭表示焦亡細(xì)胞。(B) 黑色箭頭表示正常線(xiàn)粒體；黃色箭頭，線(xiàn)粒體嵴缺失或膜損傷；紅色箭頭，自噬體內(nèi)受損的線(xiàn)粒體。

 

同時(shí)，在添加 Nigericin 引發(fā)焦亡前后，用透射電子顯微鏡觀察 LPS 原生的 THP-1 細(xì)胞，可以看到線(xiàn)粒體形態(tài)發(fā)生了變化 (圖 1C-D)：

• 添加前：線(xiàn)粒體呈典型的卵形，由雙膜囊泡和內(nèi)部嵴狀結(jié)構(gòu)組成，但在添加后，線(xiàn)粒體收縮并圓潤(rùn)起來(lái)，平均長(zhǎng)度減少約 2 倍 。
• 添加后 15 min 內(nèi)，觀察到含有損傷線(xiàn)粒體的自噬體。1 h 后，約 60% 的線(xiàn)粒體具有旋轉(zhuǎn)或消失的嵴狀結(jié)構(gòu)和/或破裂的內(nèi)線(xiàn)粒體膜 (IMM) 和外線(xiàn)粒體膜 (OMM)，線(xiàn)粒體數(shù)量減少約 2 倍。

在引發(fā)焦亡后的早期階段，線(xiàn)粒體受到了嚴(yán)重?fù)p害。此外，活化的 GSDMD-NT 會(huì)轉(zhuǎn)位至線(xiàn)粒體并在其膜上成孔，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透。

 

【能量補(bǔ)給站】

 

▐  細(xì)胞先發(fā)生焦亡？還是線(xiàn)粒體損傷 ？

研究人員評(píng)估了 LPS + Nigericin 處理過(guò)的 THP-1 細(xì)胞中的線(xiàn)粒體膜電位 (TMRM 強(qiáng)度)、細(xì)胞 ROS 產(chǎn)生 (DCFDA 強(qiáng)度) 和質(zhì)膜通透性 (SYTOX Green攝取) (圖 2A)。DCFDA 增加而 TMRM 降低發(fā)生在細(xì)胞攝取 SYTOX Green 之前，證實(shí)了線(xiàn)粒體功能不全在細(xì)胞死亡之前發(fā)生。

流式細(xì)胞術(shù)對(duì) MitoSOX (線(xiàn)粒體 ROS)、DiIC1(5) (線(xiàn)粒體膜電位) 和 SYTOX Green 攝取進(jìn)行的檢驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn) (圖 2B)。在 SYTOX Green 攝取之前約 10 min 就能檢測(cè)到 MitoSOX 和 DiIC1(5) 的顯著變化。

(A) 利用酶標(biāo)儀對(duì) LPS 或 LPS+Nigericin (Ng) 處理的 THP-1 中的 DCF 和 TRM 強(qiáng)度以及 SYTOX Green 攝取進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。(B) LPS+Nigericin (Ng) 處理的 THP1 處理后用 MitoSOX、DiIC1(5) 或 SYTOX Green 染色的的流式細(xì)胞術(shù)直方圖（上）和多個(gè)樣品的定量（下）分析結(jié)果。P，陽(yáng)性對(duì)照（抗霉素 A處理檢測(cè) MitoSOX，CCCP 處理檢測(cè) DiIC1(5)，Triton X-100 處理檢測(cè) SYTOX Green）；UNT，未經(jīng)治療。

同時(shí)，使用溴化乙錠 (EB) 處理 iBMDMs (永生化小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞) 以生成缺少線(xiàn)粒體的 ρ° 細(xì)胞。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) ρ° 細(xì)胞對(duì)于經(jīng)典及非經(jīng)典的焦亡途徑炎癥小體誘導(dǎo)的焦亡具有抗性，線(xiàn)粒體缺陷會(huì)顯著降低細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)，表明線(xiàn)粒體在焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，胞質(zhì) ROS 可放大經(jīng)典和非經(jīng)典炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

▐ GSDMD-NT 在質(zhì)膜破裂前轉(zhuǎn)移并損傷線(xiàn)粒體

為了確定在活細(xì)胞中 GSDMD-NT 是否結(jié)合并介導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙，我們對(duì)表達(dá)多西環(huán)素 (DOX) 誘導(dǎo)的 I105N GSDMD-NT 的 iBMDMs 進(jìn)行了成像，該 GSDMD-NT 在其 C 末端融合了藍(lán)色熒光蛋白 (GSDMD-NT-BFP)。I105N 突變使焦亡速度減慢，從而使得更好地檢測(cè)到死亡細(xì)胞。
 

I105N GSDMD-NT-BFP 的 iBMDMs: 

iBMDMs, Immortalized bone marrow derived macrophages，永生化骨髓源性巨噬細(xì)胞。作者使用了來(lái)自表達(dá) Cas9 的小鼠的永生化骨髓源性巨噬細(xì)胞 (iBMDM)，即 Cas9 KI iBMDM。

作者在 Cas9 KI iBMDM 中穩(wěn)定表達(dá)了 Tet3G 反式激活子，以及在 Cas9 KI Tet3G 穩(wěn)定細(xì)胞中產(chǎn)生多西環(huán)素 (Dox) 誘導(dǎo)型 GSDMD 變體，這使得編碼 NT-GSDMD 和全長(zhǎng) GSDMD (FL-GSDMD) 的轉(zhuǎn)基因能夠通過(guò)Dox 誘導(dǎo)表達(dá)。其中包含 C 端 BFP 標(biāo)簽。利用了包含 I105N 突變的 NT-GSDMD 變體 (已被證明可以防止巨噬細(xì)胞焦亡)，因?yàn)檫@種突變體比其野生型 (WT) 對(duì)應(yīng)物更容易在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到[7][8]。

 

研究表明早期的 GSDMD-NT定位到線(xiàn)粒體 (圖 3 A-E)。在 DOX 誘導(dǎo)后 4-8 h，可以檢測(cè)到 GSDMD-NT-BFP。通過(guò)活細(xì)胞共聚焦成像觀察了添加 DOX 后 6 小時(shí)開(kāi)始的 GSDMD-NT 定位、質(zhì)膜通透性 (PI 或 SYTOX 攝取) 和線(xiàn)粒體損傷 (MitoTracker、TMRM 和 MitoSOX) 的動(dòng)態(tài) (圖 3A，3B)。

圖 3. GSDMD-NT 在質(zhì)膜前易位并損傷線(xiàn)粒體^[1]。

(A 和 B) 通過(guò)DOX 誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá) GSDMD-NT(I105N)-BFP 的 iBMDM，利用MitoTracker Deep Red 和 PI（左）、TMRM 和 SYTOX Deep Red (SYTOX DR)（中）或 MitoSOX Red 和 PI（右） 進(jìn)行活細(xì)胞成像用評(píng)估線(xiàn)粒體損傷和細(xì)胞死亡，在添加 DOX 后 6 小時(shí)開(kāi)始成像。時(shí)間 0 表示首次檢測(cè)到細(xì)胞中的 PI 或 SYTOX（藍(lán)色虛線(xiàn))。

 

通過(guò)定義每個(gè)細(xì)胞在首次檢測(cè)到染料攝取 (質(zhì)膜損傷) 時(shí)的時(shí)間為 0 來(lái)同步焦亡變化：在 DOX 后，最終經(jīng) PI 或 SYTOX 攝取評(píng)估死亡的 GSDMD-NT-BFP 表達(dá)細(xì)胞中，MitoTracker 和 TMRM 強(qiáng)度都降低了(圖 3A 和 3B)，而在表達(dá) FL-GSDMD-BFP 的細(xì)胞中，線(xiàn)粒體染料強(qiáng)度和 PI 攝取保持不變 (圖 S2C-2F)。GSDMD-NT-BFP 至少在質(zhì)膜通透性增加前 50 分鐘就與線(xiàn)粒體染料定位在一起 (圖3A 和 3B)，確認(rèn)了早期的 GSDMD-NT 定位到線(xiàn)粒體。當(dāng)然，作者也通過(guò)進(jìn)一步的成像實(shí)驗(yàn)證實(shí) GSDMD-NT 與線(xiàn)粒體的共定位 (此處不再詳細(xì)展開(kāi))。

 

插一句：換個(gè)思路想，這就好比談戀愛(ài)， A 和 B 分手了，B 立刻就和 C 在一起了，說(shuō)明啥？B 和 C 肯定早就在一起了嘛！哈哈哈哈僅供理解，不可細(xì)究喔~

此外，MitoTracker 和 TMRM 強(qiáng)度逐漸下降，而 MitoSOX 信號(hào)在 PI 或 SYTOX 攝取之前增加。所有線(xiàn)粒體標(biāo)記最終消失，暗示線(xiàn)粒體溶解。在焦亡晚期，質(zhì)膜已經(jīng)被滲透后，從受損線(xiàn)粒體釋放出 MitoSOX Red。也就是說(shuō)，細(xì)胞焦亡早期，GSDMD-NT 會(huì)首先轉(zhuǎn)位至線(xiàn)粒體，且在細(xì)胞膜成孔之前，造成線(xiàn)粒體損傷。

 

▐ GSDMD-NT 直接使 OMM 和 IMM 通透

為了確定 GSDMD-NT 是否自身就能結(jié)合并損傷線(xiàn)粒體膜，作者從 HCT116 (A-C)或 iBMDMs (D-E) 中分離出線(xiàn)粒體，在存在或不存在 z-VAD-FMK (泛 Caspase 抑制劑) 或 Disulfiram (DSF, GSDMD 孔形成的有效抑制劑) 的情況下，用 GSDMD 和/或 Caspase-11 或 t-Bid 處理。GSDMD 和 Caspase-11 處理可產(chǎn)生活性的 GSDMD-NT，并通過(guò)免疫印跡檢測(cè)釋放的線(xiàn)粒體蛋白以評(píng)估線(xiàn)粒體通透性 (圖 4A 和 4B)。

圖 4. GSDMD-NT 可通透并損傷分離的線(xiàn)粒體^[1]。

(A、B 和 D) 處理后通過(guò)免疫印跡檢測(cè)上清液或線(xiàn)粒體的蛋白 (A 和 D) 以及多個(gè)實(shí)驗(yàn)的光密度測(cè)定 (B)。(C 和 E) 通過(guò) qPCR 檢測(cè)上清液中的 mtDNA。

研究表明，GSDMD-NT 直接使 OMM 和 IMM 通透，而不需要其他因素。

• 添加 Caspase-11 和 GSDMD 后 5 分鐘內(nèi)，可溶性線(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白 ACO2 和線(xiàn)粒體膜間隙蛋白 (IMS 蛋白：Cytochrome C 和 HtrA2) 從線(xiàn)粒體中釋放出來(lái)，而與膜結(jié)合的 COX IV 則沒(méi)有。泛 Caspase 抑制劑 z-VAD-FMK 抑制了釋放。

• 在添加 t-Bid 后，觸發(fā)凋亡中的 MOMP (線(xiàn)粒體外膜通透化) 而不破壞 IMM (線(xiàn)粒體內(nèi)膜)，釋放出了 Cytochrome C 和 HtrA2，但沒(méi)有釋放 ACO2 (圖 4A-B)。
• 當(dāng)線(xiàn)粒體與 GSDMD 和 Caspase-11 一起孵育時(shí)，也釋放出 mtDNA，但是單獨(dú)添加它們或者添加 t-Bid 時(shí)則沒(méi)有 (圖 4C)。
• 同時(shí)，處理分離的線(xiàn)粒體的 GSDMD 和 Caspase-11 也顯著增加了 ROS，并通過(guò) MitoSOX Red 和 DiIC1(5) 染色分別降低了膜電位 (圖中未顯示)。

此外，Disulfiram 抑制 GSDMD 孔洞形成，但不干擾 GSDMD 切割或 GSDMD-NT 與膜的結(jié)合。在添加 GSDMD 和 Caspase-11 之前預(yù)先用 DSF 孵育分離的線(xiàn)粒體 (圖 4D-E)。DSF 阻止了 Cytochrome C 和 mtDNA 的線(xiàn)粒體釋放，證實(shí)了 GSDMD-NT 孔洞使線(xiàn)粒體通透。

▐ OMM 心磷脂是 GSDMD 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷所必須的
心磷脂是由 CRLS1 合成并由 PLSCR3 外化到外線(xiàn)粒體膜 (OMM) 上 (圖 5 A)，為研究 GSDMD-NT 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷是否需要 OMM 心磷脂，作者對(duì) iBMDMs 中對(duì) CRLS1 和 PLSCR3 進(jìn)行了基因敲除 (Cris1-/-和 Plscr3-/- iBMDMs)，并用 LPS 和 Nigericin 進(jìn)行處理。

圖 5. OMM心磷脂是GSDMD介導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷所必需[1]。

(A) 心磷脂合成和易位示意圖。PG，磷脂酰甘油；CDP-DAG，二磷酸胞苷-二�；�甘油。(B) LPS或 LPS+Nigericin 處理的表達(dá) mNG-GSDMD 的 WT、Plscr3^-/-或 Crlsr1^-/- iBMDM 的共聚焦活細(xì)胞成像，在添加 Nigericin 30 分鐘后進(jìn)行 MitoTracker 深紅染色。白色箭頭表示 GSDMD 的線(xiàn)粒體募集。(C) 未處理或Nigerici n處理 30 分鐘后，LPS 預(yù)處理的 iBMDM 的全細(xì)胞裂解物 (WCL)、胞質(zhì) (細(xì)胞) 和線(xiàn)粒體 (mito)的免疫印跡。 (D) 通過(guò) qPCR 檢測(cè)胞質(zhì) mtDNA。

 

研究發(fā)現(xiàn)， OMM 心磷脂介導(dǎo)了 GSDMD 依賴(lài)性的線(xiàn)粒體損傷。

• 在 LPS+Nigericin 處理的 Cris1-/- 和 Plscr3-/- iBMDMs 中，GSDMD-NT 沒(méi)有被招募到線(xiàn)粒體 (圖 5B)，而線(xiàn)粒體完整性和膜電位、線(xiàn)粒體數(shù)量和平均長(zhǎng)度以及損害線(xiàn)粒體的百分比幾乎恢復(fù)到未處理的 WT iBMDMs 的狀態(tài) (圖中未顯示)。

• 此外，線(xiàn)粒體 ROS (圖中未顯示) 和 Cytochrome C 和 mtDNA 的胞質(zhì)釋放 (圖5C-D) 也被阻止。一致地，用 GSDMD 和 Caspase-11 處理的 Crls1-/- 和Plscr3-/- iBMDMs 的分離線(xiàn)粒體沒(méi)有釋放 Cytochrome C、HtrA2 或 mtDNA (圖中未顯示)。

同時(shí)，GSDMD 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷誘導(dǎo) 3’端- 5’端的核酸外切酶 PNPT1 釋放入胞質(zhì)，引發(fā)廣泛的 mRNA 降解以加重細(xì)胞焦亡發(fā)生、放大下游炎性反應(yīng)。也正是如此，提供了一個(gè)強(qiáng)大的正反饋機(jī)制來(lái)放大細(xì)胞死亡，被稱(chēng)為“不歸路”。此外，該研究還揭示了線(xiàn)粒體損傷增強(qiáng)細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)的機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。

 

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LPS + Nigericin 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞焦亡。

MitoTracker Deep Red  / MitoTracker Green 線(xiàn)粒體紅色/綠色熒光探針。

TMRM 膜滲透性的陽(yáng)離子熒光探針，檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位。

DCFDA 具有細(xì)胞滲透性，可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的 ROS。

MitoTEMPO 是一種靶向線(xiàn)粒體的超氧化物歧化酶模擬物，有著清除超氧化物和烷基自由基的能力。

MVRGreen 一種可滲透的 DNA 染料。 細(xì)胞焦亡化合物庫(kù)‍ 收錄了 1186 種細(xì)胞焦亡相關(guān)產(chǎn)品，可以用于細(xì)胞焦亡信號(hào)通路及相關(guān)疾病的研究。

MCE的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

參考文獻(xiàn)：
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[2] Dominic P Del Re, et al. Fundamental Mechanisms of Regulated Cell Death and Implications for Heart Disease. Physiol Rev. 2019 Oct 1;99(4):1765-1817.
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[8] Evavold CL, et al. Control of gasdermin D oligomerization and pyroptosis by the Ragulator-Rag-mTORC1 pathway. Cell. 2021 Aug 19;184(17):4495-4511.e19.