斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)在解析孔板尺寸對研究影響的應(yīng)用

斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)(DanioVision)是一種多功能研究工具，可使用適合該設(shè)備的孔板來研究斑馬魚。斑馬魚研究中使用的標(biāo)準孔板有 24、48 或 96 孔。
 
孔板尺寸是否重要？
Wolter和Svoboda在一篇《神經(jīng)科學(xué)方法》（Neuroscience Methods）論文中描述了他們?nèi)绾问褂?a >斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)來研究使用孔板的大小尺寸是否會影響基于運動的晝夜節(jié)律[1]。原因顯而易見：孔板中的孔數(shù)越多，意味著（可移動的）空間越小。增加研究的孔數(shù)可以提高研究的產(chǎn)量，但可能會降低研究結(jié)果的穩(wěn)定性。
 
使用斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)進行研究
斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)（DanioVision）是一款用于斑馬魚和其它小型生物的高通量跟蹤系統(tǒng)，可應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究，例如癲癇行為研究、晝夜節(jié)律、運動控制、運動障礙、神經(jīng)發(fā)育等。無論使用的是6、12、24、48還是96孔板，該觀察箱都可以完美地容納孔板，并對其中的斑馬魚幼魚進行高通量觀察分析。也可以支持使用培養(yǎng)皿或其他小容器。
   
孔板尺寸的變化會導(dǎo)致行為差異嗎？
斑馬魚幼魚在環(huán)境變化（如光暗轉(zhuǎn)換）的觸發(fā)下會增加運動，Emran 等人于2008年對這一特定現(xiàn)象進行了研究[2]。基于此，Wolter 和 Svoboda在他們的論文中指出，許多研究小組都在研究斑馬魚的行為，以觀察神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能，但所使用的孔板卻存在很大差異：有些小組在 96 孔板中進行這些行為測定，而有些小組則在 24 孔板中進行這些測定。這種尺寸差異對斑馬魚發(fā)育階段的（晝夜節(jié)律）行為有何影響？
 
孔板中的長期實驗面臨風(fēng)險
使用斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)對斑馬魚在 5-23 dpf 期間的晝夜節(jié)律（通過運動）進行了跟蹤和分析。圖 1顯示了同時跟蹤24只幼魚的示例，并顯示了幼魚最初五分鐘的活動軌跡。 他們在 12 孔板（直徑20毫米）、24 孔板（直徑15毫米）、48 孔板（直徑 10 毫米）和 96 孔板（直徑 6.54 毫米）中記錄了 5-6 dpf 幼魚27小時的運動活動（圖 2）。無論孔板大小如何，幼魚的晝夜節(jié)律看起來都相對典型。 然而，在單獨分析時，典型晝夜節(jié)律(typical CR)的百分比隨著每板孔數(shù)的增加而下降。在48孔板和96孔板中跟蹤幼魚與在12孔板和24孔板中跟蹤幼魚相比，個體典型晝夜節(jié)律出現(xiàn)的一致性較差。進一步分析比較了不同孔板的典型晝夜節(jié)律百分比，12孔板和24孔板的典型晝夜節(jié)律出現(xiàn)率沒有差異，但24孔板和48孔板以及24孔板和96孔板的典型晝夜節(jié)律出現(xiàn)率存在顯著差異。
在含有24個或更多孔的板中飼養(yǎng)幼魚時，除了晝夜節(jié)律變異性增加外，幼魚活動的幅度也急劇下降50%以上。在孔數(shù)較多的孔板中看到的個體變異性增加可能是由于孔徑減小，活動空間就更小了。由于在12孔板或24孔板中跟蹤的幼魚的典型晝夜節(jié)律出現(xiàn)率沒有差異，他們決定在24孔板中進行后續(xù)實驗。在這些孔板中，幼魚表現(xiàn)出更高的運動活性。
本文發(fā)現(xiàn)，當(dāng)監(jiān)測5-23 dpf幼魚的運動活動作為晝夜節(jié)律的讀數(shù)時，在96孔板中跟蹤幼魚的高通量方法可能會面臨挑戰(zhàn)。對于短期實驗而言，使用96孔板所發(fā)現(xiàn)的這些限制還有待證實。
 
總結(jié)
最終，Wolter 和 Svoboda 提出了明確的建議：由于晝夜節(jié)律（通過運動行為衡量）的變異性，長期斑馬魚行為學(xué)實驗不推薦在48孔板或96孔板中進行，使用24孔板使這些研究從高通量轉(zhuǎn)變?yōu)橹械韧�量將會是更好的選擇。
 
參考文獻
1.Wolter, Matthew E.; Svoboda, Kurt R. (2020). Doing the locomotion: Insights and potential pitfalls associated with using locomotor activity as a readout of the circadian rhythm in larval zebrafish. J. Neurosci. Methods, 330, 108465
2.Emran, Farida; Rihel, Jason; Dowling, John E. (2008). A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp.(20), 923