重組胰蛋白酶特點解析及其在疫苗中的應用價值

一，什么是重組胰蛋白酶？

重組胰蛋白酶是指利用基因重組技術生產的胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)，它是絲氨酸蛋白水解酶家族成員之一，屬肽鏈內切酶，國際酶學編號為：EC3.4.4.4。
 

二，胰蛋白酶的來源及水解特異性

最初發(fā)現(xiàn)并使用的胰蛋白酶是從牛、羊、豬的胰臟提取的，其廣泛存在于在脊椎動物和微生物中，不同來源其最適溫度有所不同，其中哺乳動物源胰蛋白酶與人體最為相近。
 

胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原合成場所，合成后作為胰液的成分而分泌，經腸激酶或胰蛋白酶切去前導肽而形成具有活性的胰蛋白酶，為肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷，如果酸性殘基位于裂解位點的任一側，則水解速率較慢，如果脯氨酸殘基位于裂解位點的羧基側，則不會發(fā)生裂解。
 

胰蛋白酶不僅作為消化酶，同時還能激活糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起激活作用，是特異性最強的蛋白酶。在決定蛋白質的氨基酸排列中，它是必不可少的工具酶。

 

三，重組胰蛋白酶相對于動物提取胰蛋白酶的優(yōu)點

首先，提高了疫苗的安全性，因為動物提取胰蛋白酶可能含有致病因子、動物病毒、朊蛋白等外源性風險物質，從而導致在疫苗中的殘留，而重組胰蛋白酶不含這些外來風險物質(珠海冀百康的重組胰蛋白酶在生產過程中不使用任何動物來源的材料，符合最新發(fā)布的重組胰蛋白酶標準)。其次，是產量大幅度提高，降低生產成本、降低分離純化技術門檻，使之能夠進行大規(guī)模生產和商品化應用(或工業(yè)化應用)，且激活后的胰蛋白酶的酶切特異性與動物胰腺來源一致。最后，動物提取胰蛋白酶由于動物來源不同導致批次間差異較大，而重組胰蛋白酶的原材料穩(wěn)定，故產品質量穩(wěn)定，批間差異小。
 

四，胰蛋白酶在疫苗中生產中的應用

疫苗是目前預防疾病發(fā)生和傳播最為有效的方式，主流生產疫苗的主要方法有：雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)和動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
 

目前使用最為廣泛的是動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，動物細胞在適宜環(huán)境下能夠迅速增殖，并且由于其與人體組織細胞極為相似，故而其生產的疫苗具有很高的免疫原性。傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)疫苗系統(tǒng)則存在許多不足之處，比如培養(yǎng)的病毒容易發(fā)生變異;與人群流行病毒株存在差異導致疫苗效果不佳或無預防效果;病毒大范圍傳播時健康雞胚供應受限致使短時間內無法滿足對疫苗的需求。

 

1. 用于疫苗生產中細胞培養(yǎng)時的細胞解離

貼壁依賴型動物細胞在培養(yǎng)時都是貼附于固相表面進行生長，一般貼附于培養(yǎng)器皿表面或微載體，我們稱之為貼壁培養(yǎng)。細胞貼壁后迅速鋪展并以有絲分裂的方式進行增殖，并很快進入對數(shù)生長期。數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并在形成致密的單層細胞后停止增殖，隨后進行放大傳代培養(yǎng)，此時就需要使用細胞消化液對貼壁細胞進行處理，使之成為單個細胞并且不對其造成損傷，其中酶類細胞消化液主要成分為蛋白水解酶和緩沖保護溶液。當前市場上所售以胰蛋白酶消化液為主，胰蛋白酶能夠水解細胞間的沾粘蛋白，釋放出單個獨立細胞，并且很好的保持細胞的完整性和細胞活性。

 

2. 用于疫苗生產中裂解病毒

以細胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的流感病毒血凝素HA為例：流感病毒血凝素HA被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2后才能夠介導病毒囊膜與靶細胞融合，開始病毒生命周期，因此HA的裂解成為病毒感染細胞的首要因素，因此可以采用外加胰蛋白酶的方式進行裂解，以進行病毒疫苗的生產，其可有效的提高病毒產量，從而進行大規(guī)模的生產并簡化相關生產工藝。

3. 用于消除疫苗生產過程中可能造成的生物危害

當前基因工程疫苗是國際社會生物安全管理的一個集中點，在基因工程疫苗的研制過程中，經過基因重組而攜帶外源基因的生物體一旦逃逸到環(huán)境中，經過基因整合后，可能會引起生態(tài)系統(tǒng)的結構發(fā)生改變，打破其在長期進化過程中所形成的生態(tài)平衡，威脅自然界中的生物，有些病毒具有導致靶組織損傷的基因，可能使原本無害的微生物變得極其危險。
 

我國對于生物安全相當重視，并建立了一整套法律法規(guī)以保障生物安全。胰蛋白酶可用于生產過程中生物危害的消除，病毒粒子主要依靠表面結構進行吸附和侵入宿主細胞，胰蛋白酶能水解并破壞病毒粒子的衣殼蛋白，并造成病毒粒子脂質的丟失，從而讓病毒粒子不再具有吸附和侵入能力，進而達到消除可能形成的危害，達到防患與未然的目的。
 

五，逐典重組胰蛋白酶是一款滿足藥典要求的GMP級非動物源胰蛋白酶

Trypelectase 重組胰蛋白酶是逐典生物專門為疫苗、病毒載體生產設計，具有高效、非動物源和高質量標準的特點。該胰蛋白酶氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶一致，由大腸桿菌(E.col) 重組表達生產。在GMP級別環(huán)境中生產的重組胰蛋白酶能高效消化貼壁細胞且不造成傷害，產品質量滿足藥典要求。

逐典重組胰蛋白酶特點

1.GMP級生產環(huán)境、符合藥典標準

2.重組生產、不含雜酶

3.批量生產、質量穩(wěn)定

4.高純度、高比活

5.非動物源原料

逐典重組胰蛋白酶應用場景

組織塊的消化解離和原代細胞的獲取、貼壁細胞的傳代消化和收獲、微載體方法培養(yǎng)的細胞消化和收獲。

實驗數(shù)據(jù)

CT26.WT 和 HEK293FT 細胞消化實驗

CT26WT和HEK293FT在經Trypelectase重組胰酶消化3min后解離效果較好，細胞活率顯示對細胞傷害較小，不會影響細胞傳代。

 

Trypelectase重組豬胰酶對細胞消化過程及傳代24h細胞貼壁圖