細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞消化的分類及方法

細(xì)胞是生物學(xué)實驗的重要材料，也是生物細(xì)胞學(xué)實驗的基礎(chǔ)。藥物、基因功能、疾病機理等的相關(guān)研究多數(shù)需要在細(xì)胞水平進行闡釋。在細(xì)胞培養(yǎng)和消化的操作過程中，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，因此每個環(huán)節(jié)都有可能導(dǎo)致操作的失敗。以下是我們匯總了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞消化的小貼士，希望能給正操作細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞消化的研發(fā)人員帶來幫助。
 

細(xì)胞系身份需明確

之所以選定某種細(xì)胞系開展實驗，是因為所選細(xì)胞系的一些特性符合研究方向的設(shè)定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達特性等。一旦用錯了細(xì)胞株，對研究結(jié)果的判斷就會帶來很大的誤差和不確定性。
 

而近年來，多個權(quán)威機構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系在培養(yǎng)和流通過程中，出現(xiàn)了很嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不完全統(tǒng)計，單就HeLa細(xì)胞系導(dǎo)致的污染致使3萬多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性存在問題（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而這種情況不僅僅限于HeLa細(xì)胞。多個權(quán)威機構(gòu)研究人員檢測發(fā)現(xiàn)超過451個細(xì)胞系已被其它細(xì)胞完全吸收，在所檢測細(xì)胞中污染占比46%，可見細(xì)胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍。因此，做實驗前對細(xì)胞株驗明正身非常重要。如果是在機構(gòu)購買的細(xì)胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報告。

細(xì)胞培養(yǎng)和消化

細(xì)胞培養(yǎng)大致分為兩種，一種是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，一種是貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，無論是哪種方式，進行細(xì)胞培養(yǎng)時一般會通過以下幾個步驟：

細(xì)胞準(zhǔn)備—細(xì)胞傳代—細(xì)胞培養(yǎng)基配置—細(xì)胞接種—培養(yǎng)條件控制—細(xì)胞觀察和培養(yǎng)—細(xì)胞實驗—細(xì)胞凍存
 

當(dāng)然以上只是細(xì)胞培養(yǎng)過程的一個基本框架，實際操作可能會因細(xì)胞類型、實驗要求和實驗室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程而有所不同。

細(xì)胞消化是研發(fā)人員在操作細(xì)胞培養(yǎng)過程中一個步驟，一般細(xì)胞長至80%-90%密度則需要傳代消化，貼壁細(xì)胞傳代前，需要把細(xì)胞用消化試劑從培養(yǎng)容器表面解離出來，細(xì)胞得以分離成單個懸液傳代至含新鮮培養(yǎng)基的新容器內(nèi)；常見的細(xì)胞消化方法有三種：酶消化法、離子螯合法、機械消化法。其中，酶消化法是用得最多的，主要使用胰蛋白酶，一般濃度在0.25-0.5%，消化的時間根據(jù)細(xì)胞種類、作用溫度等因素而變化。一般來說，0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37℃條件下消化1-5分鐘就足夠了。需要注意的是，Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，因此不含Ca2+、Mg2+，含EDTA的胰酶活性更高; 最后，可用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化。
 

胰蛋白酶大致可以分為兩種，一種是傳統(tǒng)使用的動物源性的胰蛋白酶，主要提取自�；蜇i的胰腺組織，其缺點是會帶來病毒污染的風(fēng)險；另一種則是非動物源性胰酶，即利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的重組胰蛋白酶。重組胰蛋白酶具有許多潛在用途，包括用于生產(chǎn)藥品、用作研究工具以及生物技術(shù)應(yīng)用，例如蛋白類藥物的生產(chǎn)、細(xì)胞的分離、疫苗生產(chǎn)以及用于細(xì)胞分析的組織樣本的制備，同時解決了傳統(tǒng)使用的豬或牛胰蛋白酶可能帶來病毒污染的風(fēng)險。我國2020版藥典第一次收錄了無動物源性重組胰蛋白酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。總體而言，重組胰蛋白酶在生物藥及科研領(lǐng)域是不可缺少的工具酶。

重組胰蛋白酶在實際應(yīng)用中的使用步驟：

① 配制緩沖液：用滅菌水配制10L HBSS平衡鹽溶液。

HBSS平衡鹽溶液配方：400mg/L KCl，60mg/L KH2PO4，350mg/L NaHCO3，8000mg/L NaCl，121mg/L Na2HPO4·12H2O，1000mg/L葡萄糖。

② 取1g重組胰蛋白酶（細(xì)胞培養(yǎng)級），用HBSS平衡鹽溶液溶解澄清，使胰蛋白酶的酶活濃度為500USP units/ml-1500 USP units/ml，或者使胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.1mg/ml-0.3mg/ml。（500USP units/ml的濃度適合大部分細(xì)胞的消化，原代細(xì)胞、組織等可適當(dāng)提高濃度至1500 USP units/ml）

注意事項

1）逐典生物重組胰蛋白酶消化液含有EDTA，應(yīng)注意其不同細(xì)胞的使用適配性。且本重組胰蛋白酶消化液不含抑菌劑，使用過程中要特別注意無菌操作，避免消化液被微生物污染。

2）建議將本重組胰蛋白酶消化液分裝為100ml/瓶，在-15~-20℃條件下存放，能穩(wěn)定存放12 個月。不宜 4℃長期保存，切忌反復(fù)凍融造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機會。

逐典重組胰蛋白酶是一款滿足藥典要求的GMP級非動物源胰蛋白酶

Trypelectase 重組胰蛋白酶是逐典生物專門為疫苗、病毒載體生產(chǎn)設(shè)計，具有高效、非動物源和高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的特點。該胰蛋白酶氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶一致，由大腸桿菌(E.col) 重組表達生產(chǎn)。在GMP級別環(huán)境中生產(chǎn)的重組胰蛋白酶能高效消化貼壁細(xì)胞且不造成傷害，產(chǎn)品質(zhì)量滿足藥典要求。

逐典重組胰蛋白酶特點

1.GMP級生產(chǎn)環(huán)境、符合藥典標(biāo)準(zhǔn)

2.重組生產(chǎn)、不含雜酶

3.批量生產(chǎn)、質(zhì)量穩(wěn)定

4.高純度、高比活

5.非動物源原料

逐典重組胰蛋白酶應(yīng)用場景

組織塊的消化解離和原代細(xì)胞的獲取、貼壁細(xì)胞的傳代消化和收獲、微載體方法培養(yǎng)的細(xì)胞消化和收獲。

實驗數(shù)據(jù)

CT26.WT 和 HEK293FT 細(xì)胞消化實驗

CT26WT和HEK293FT在經(jīng)Trypelectase重組胰酶消化3min后解離效果較好，細(xì)胞活率顯示對細(xì)胞傷害較小，不會影響細(xì)胞傳代。

Trypelectase重組豬胰酶對細(xì)胞消化過程及傳代24h細(xì)胞貼壁圖