單細胞RNA測序及全外顯子組測序在甲狀腺癌去分化的綜合分析中的應用
期刊：Science advances
影響因子：13.6
主要技術：單細胞RNA測序（scRNA-seq），全外顯子組測序（WES）
導語
去分化是甲狀腺癌患者較差預后的重要指標，其異質性及去分化機制尚不明確。本文使用scRNA-seq，構建了甲狀腺癌的單細胞圖譜，描繪了其去分化過程和抑制性免疫微環(huán)境。發(fā)育軌跡表明，間變性甲狀腺癌（ATC）細胞來源于乳頭狀甲狀腺癌（PTC）細胞的一個小子集�？截悢蹈淖兒娃D錄調控網絡的綜合分析，揭示了CREB3L1在ATC發(fā)育中的潛在功能作用。分化相關途徑中的多個基因作為CREB3L1的下游靶點參與，CREB3L1的高表達預測了PTC的較高復發(fā)風險。本研究為了解甲狀腺癌的異質性和分子機制提供了重要信息，并強調了CREB3L1在其去分化過程中的潛在驅動作用。
關鍵技術
單細胞RNA測序（scRNA-seq）
全外顯子組測序（WES）
研究結果
1. 甲狀腺癌的單細胞圖譜
為了探索甲狀腺癌的細胞組成，作者通過scRNA-seq和WES分析了一名PTC患者的PTC/ATC腫瘤和正常甲狀腺組織（圖1A）。質量控制后，共鑒定16個細胞群，3個甲狀腺癌細胞亞群（PTC和ATC），2個成纖維細胞亞群，8個免疫細胞群（B細胞、T細胞和巨噬細胞）（圖1 B）。其中PTC細胞被分為亞群簇（PTC 1和PTC 2）（圖1B），具有明顯的異質性。而PTC和ATC細胞可通過PI3K和增殖標志物的高表達進行區(qū)分。
ATC衍生的NK和T細胞高度表達淋巴功能障礙標志物，且在ATC中觀察到M1/M2比值顯著降低表明腫瘤進展和免疫抑制。由于FAP + 成纖維細胞促進免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，ATC中較低的成纖維細胞1（FAP − ）/成纖維細胞2（FAP + ）比率表明ATC抗腫瘤免疫受到抑制（圖1C）。CellphoneDB分析，成纖維細胞與癌細胞中的ATC細胞具有特異性強相互作用，并且旨在與M2和TAMC相互作用。所有的證據都表明ATC中存在免疫抑制微環(huán)境。
圖1 甲狀腺癌的單細胞特征
2. 甲狀腺癌去分化過程中轉錄水平的動態(tài)變化
為了深入了解PTC到ATC的細胞進展，作者將PTC細胞分為PTC衍生的PTC細胞（pPTC）和ATC衍生的PTC細胞（aPTC）（圖2A）。細胞軌跡分析揭示了ATC和PTC具有不同的進展途徑（圖2C）。aPTC細胞定位于ATC進展軌跡上，并且它們中的一個子集在分叉后接近ATC細胞，表明ATC可能來源于PTC細胞的亞群（即aPTC）。沿著PTC到ATC細胞的軌跡，作者鑒定了許多參與癌癥發(fā)展的基因表達變化和多種癌癥相關途徑的不同激活。這些發(fā)現表明濾泡細胞進展為PTC或ATC遵循不同的進化途徑，涉及特定的細胞亞群和多個途徑的激活。
圖2甲狀腺癌去分化過程中的進化軌跡和轉錄水平的變化
3. CNAs在甲狀腺癌去分化中的作用
為了鑒定ATC和PTC細胞之間基因組的差異，作者基于單細胞數據推斷拷貝數改變（CNA），在ATC細胞中鑒定出比PTC細胞中更高的CNA，表明ATC細胞中染色體不穩(wěn)定性增加（圖3A）。結合WES分析結果，作者鎖定了在三種ATC腫瘤中觀察到的Chr 11-CNA（41.1至47.9 M）（圖3B和圖3C）。氣泡圖顯示，與正常細胞和PTC細胞相比，位于該CNA區(qū)域的大多數基因在ATC細胞中高度表達（圖3C）。此外，該Chr 11-CNA在從正常細胞到ATC細胞的細胞軌跡的中途開始增加，并且在ATC細胞中高度富集，但在PTC細胞中不富集（圖3D），表明該區(qū)域中的特定基因可能參與aPTC的ATC進展。
圖3 甲狀腺癌去分化過程中的CNAs
4. CREB3L1作為ATC中的主轉錄調節(jié)因子
由于上述多種途徑與ATC進展相關，作者推測上游轉錄因子（TF）可能是ATC進展的關鍵調節(jié)因子。因此，作者用scRNA-seq數據進行SCENIC分析以重建共表達模塊并鑒定ATC進展期間的關鍵TF調節(jié)劑。分析發(fā)現CREB3L1在ATC衍生的甲狀腺癌細胞中富集，特別是在ATC細胞中高表達，表明CREB3L1表達與ATC進展相關。在ATC細胞中觀察到大量CREB3L1陽性細胞（圖4 B），并沿濾泡-aPTC-ATC軌跡逐漸富集（圖4C）。CREB3L1恰好位于上述ATC相關的Chr11-CNA中，為它在ATC進展中的潛在作用提供了重要支持。為探究CREB3L1在ATC發(fā)展中的作用，作者進一步研究了CREB3L1的靶基因及其在ATC中的相關通路。ChIP-seq分析結果顯示，CREB3L1的結合區(qū)在基因啟動子中高度富集（圖4 E），2222個基因被鑒定為CREB3L1的潛在靶標，其表達傾向于沿著ATC進展而增加（圖4F）。CREB3L1靶基因在ATC細胞中富集EMT和mTOR信號傳導（圖4G），與scRNA-seq中ATC轉錄組的通路富集分析一致。這些發(fā)現為CREB3L1通過EMT和mTOR途徑在ATC發(fā)展中的主轉錄調節(jié)作用提供了強有力的支持。
5. 驅動的通路與甲狀腺癌進展的相關性
對來自GEO數據庫的4項獨立的甲狀腺癌bulk RNA做GSEA分析，進一步評估CREB3L1對ATC形成的影響。分析結果均顯示，CREB3L1和參與EMT/mTORC1途徑的基因在ATC中顯著富集（圖5A）。根據CREB3L1表達水平將來自TCGA的甲狀腺癌樣本分為兩組。在兩組之間總共鑒定了1115個DEGs，EMT相關基因在CREB3L1high組中高表達（圖5 B）。有趣的是，CREB3L1高表達可以預測TCGA中PTC患者的顯著更差的總體存活率（圖5E）。為了進一步評估CREB3L1的功能，作者在PTC細胞系中過表達CREB3L1，其遷移能力顯著增加（P = 0.004）（圖5G），并誘導了多種EMT相關標志物高表達，抑制與EMT負相關的E-鈣粘蛋白的表達（圖5 H）。此外，CREB3L1染色在其他癌癥的甲狀腺轉移中不存在（例如，肺腺癌、非霍奇金淋巴瘤和鱗狀細胞癌）。因此，CREB3L1免疫組化染色陽性有助于該病的鑒別診斷和指導臨床治療，這些發(fā)現表明CREB3L1表達可能決定甲狀腺癌的細胞命運，并促進甲狀腺癌患者的ATC進展和不良臨床結局。
圖5 CREB3L1在甲狀腺癌進展中的功能
參考文獻：
Luo H, Xia X, Kim GD, et al (2021) Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Sci Adv 7:eabf3657. https://doi.org/10.1126/sciadv.abf3657
