細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過程說明
細(xì)胞復(fù)蘇是通過快速融化的手段保證細(xì)胞外結(jié)冰晶在很短時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞重新結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害，復(fù)蘇成功的細(xì)胞可以保持很高的活力。細(xì)胞復(fù)蘇的過程需要嚴(yán)格的溫度控制，以確保細(xì)胞的活力和完整性。一旦溫度過高或過低，都可能對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，影響實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。在操作過程中，科學(xué)家們必須全神貫注，如同呵護(hù)脆弱的生命之花。
細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。
2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面，保證無菌。
3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。
一、取出凍存管
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對(duì)應(yīng)編號(hào)。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。
二、迅速解凍
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。
三、平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3分鐘。
四、制備細(xì)胞懸液
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
3.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞濃度以5×105/mL為宜。
六、培養(yǎng)細(xì)胞
將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞情況而定。
七、記錄復(fù)蘇日期
八、結(jié)果分析：
判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。
如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長，達(dá)到正常的生長特性（比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲(chǔ)存數(shù)量。
注意事項(xiàng)：
1. 實(shí)驗(yàn)前做好準(zhǔn)備工作，如預(yù)熱水浴鍋、配制并預(yù)熱培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備。確保避免因?qū)嶒?yàn)準(zhǔn)備不充分導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇失敗。
2. 取細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施，帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。
3. 若液氮罐距離水浴鍋距離較遠(yuǎn)，需要對(duì)凍存管進(jìn)行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁，避免路途中導(dǎo)致細(xì)胞融化。可用-80℃預(yù)冷的程序降溫盒轉(zhuǎn)移細(xì)胞，但不可長時(shí)間滯留，應(yīng)盡快化凍復(fù)蘇。
4. 細(xì)胞放入水浴中注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時(shí)晃動(dòng)，使其受熱均勻，并防止水浴時(shí)水進(jìn)入細(xì)胞凍存管污染細(xì)胞。打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br />
5. 若細(xì)胞較珍貴，在吸取細(xì)胞時(shí)要保留槍頭或移液管，用培養(yǎng)基沖洗上面殘留的細(xì)胞。
6. 快速操作的目的：一是防止長時(shí)間常溫下DMSO對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；二是在低溫到常溫的過程中，水分會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞并形成冰晶，快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細(xì)胞。
7. 離心的主要目的是通過換液取出含有DMSO的凍存液，若細(xì)胞對(duì)DMSO耐受，可不離心。
細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。
2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面，保證無菌。
3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。
一、取出凍存管
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對(duì)應(yīng)編號(hào)。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。
二、迅速解凍
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。
三、平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3分鐘。
四、制備細(xì)胞懸液
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
3.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞濃度以5×105/mL為宜。
六、培養(yǎng)細(xì)胞
將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞情況而定。
七、記錄復(fù)蘇日期
八、結(jié)果分析：
判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。
如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長，達(dá)到正常的生長特性（比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲(chǔ)存數(shù)量。
注意事項(xiàng)：
1. 實(shí)驗(yàn)前做好準(zhǔn)備工作，如預(yù)熱水浴鍋、配制并預(yù)熱培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備。確保避免因?qū)嶒?yàn)準(zhǔn)備不充分導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇失敗。
2. 取細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施，帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。
3. 若液氮罐距離水浴鍋距離較遠(yuǎn)，需要對(duì)凍存管進(jìn)行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁，避免路途中導(dǎo)致細(xì)胞融化。可用-80℃預(yù)冷的程序降溫盒轉(zhuǎn)移細(xì)胞，但不可長時(shí)間滯留，應(yīng)盡快化凍復(fù)蘇。
4. 細(xì)胞放入水浴中注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時(shí)晃動(dòng)，使其受熱均勻，并防止水浴時(shí)水進(jìn)入細(xì)胞凍存管污染細(xì)胞。打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br />
5. 若細(xì)胞較珍貴，在吸取細(xì)胞時(shí)要保留槍頭或移液管，用培養(yǎng)基沖洗上面殘留的細(xì)胞。
6. 快速操作的目的：一是防止長時(shí)間常溫下DMSO對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；二是在低溫到常溫的過程中，水分會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞并形成冰晶，快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細(xì)胞。
7. 離心的主要目的是通過換液取出含有DMSO的凍存液，若細(xì)胞對(duì)DMSO耐受，可不離心。
- 細(xì)胞因子IL-23信號(hào)通路原理及在自免藥物開發(fā)上的應(yīng)用
- 多能干細(xì)胞的歷史及在臨床上的應(yīng)用
- 國內(nèi)干細(xì)胞相關(guān)政策梳理匯總及分析
- 巨噬細(xì)胞在不同疾病下的功能變化及其激活和分化指南
- 文獻(xiàn)解讀：GSK3調(diào)控信號(hào)影響牛骨骼肌纖維/脂肪生成祖細(xì)胞的成脂分化
- 多能干細(xì)胞在研情況、研究優(yōu)勢及相關(guān)細(xì)胞因子應(yīng)用
- IPSC化學(xué)重編程技術(shù)與傳統(tǒng)重編程技術(shù)的區(qū)別及優(yōu)勢
- 細(xì)胞因子IL-17在靶向藥物及自身免疫性疾病中的應(yīng)用優(yōu)勢
- MCE教師節(jié)直播:細(xì)胞凋亡的機(jī)制、標(biāo)志物與檢測方法
- 百螢SO Green 520WS單線態(tài)氧探針促銷，買即送京東卡
- 中喬新舟開學(xué)特惠活動(dòng)：細(xì)胞系5折無需捆綁輕松購
- 上海逐典生物參展2024 IDC第三屆新藥研發(fā)影響力大會(huì)
- 耐思推出細(xì)胞培養(yǎng)新品耗材，基質(zhì)膠試用裝等你來領(lǐng)
- MCE 第三屆細(xì)胞攝影大賽開啟，多種好禮等你拿
- 博鷺騰CCK-8檢測試劑盒新品上市,多款試劑可免費(fèi)試用
- 中喬新舟示蹤細(xì)胞限時(shí)送套餐包，評(píng)論集贊贏凍存液
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com