ArrayJet生物芯片點(diǎn)樣儀在能量代謝對(duì)骨骼肌發(fā)育機(jī)制的研究的應(yīng)用

骨骼肌由多個(gè)單核成肌細(xì)胞融合而成，該過(guò)程受成肌細(xì)胞增殖和分化的影響。鑒于蛋白質(zhì)是大多數(shù)生物過(guò)程的執(zhí)行者，因此在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行調(diào)控因子和機(jī)制的研究，成為理解骨骼肌發(fā)育的重要基礎(chǔ)。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜分析技術(shù)、無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，皆在成本、分辨率和靈敏度上有一定局限性。與其相比，蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片技術(shù)，利用抗體陣列結(jié)合和識(shí)別生物樣本中大量待測(cè)蛋白質(zhì)，不僅具有高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，還可以大大減少樣本的消耗，為蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了高通量的技術(shù)手段。家禽中的雞作為肌肉研究的理想模式生物，其相關(guān)的抗體陣列十分有限，因此，有必要建立高通量的雞肌肉抗體陣列對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行探索。已有研究表明能量代謝可影響骨骼肌的生長(zhǎng)，能量代謝包括物質(zhì)代謝和能量產(chǎn)生，兩者相互協(xié)調(diào)。其中線粒體復(fù)合物可抑制肌管形成和肌細(xì)胞生成素表達(dá)，而糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸可以重塑細(xì)胞代謝譜，促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化，但是目前能量調(diào)節(jié)對(duì)骨骼肌的具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。
 

文章題目為“Chicken muscle antibody array reveals the regulations of LDHA on myoblast differentiation through energy metabolism”于2023年10月發(fā)表在International Journal of Biological Macromolecules雜志，作者來(lái)自于廣東省農(nóng)用動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

在這項(xiàng)研究中，作者開(kāi)發(fā)并使用了由5263種單抗組成的雞肌肉蛋白抗體微陣列，對(duì)雞原代骨骼肌母細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行研究。首先從小鼠腹水中收集純化的蛋白免疫抗體，使用英國(guó)ArrayJet公司的生物芯片點(diǎn)樣儀Marathon（新型號(hào)Mercury 100）點(diǎn)印在硝化纖維素膜包被的玻璃片上，每個(gè)樣品10nl。隨后用生物素標(biāo)記蛋白樣品混合物（提取自成肌細(xì)胞和肌小管）對(duì)玻片進(jìn)行孵育，完成后用鏈霉親和素雜交，最后使用熒光芯片掃描儀檢測(cè)Cy3熒光信號(hào)。其中(熒光信號(hào)強(qiáng)度-背景)/背景信號(hào)>2.5的陣列點(diǎn)被定義為陽(yáng)性點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。芯片篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在糖酵解過(guò)程中起重要作用的乳酸脫氫酶(LDHA)，在成肌細(xì)胞的增殖到分化過(guò)程中顯著上調(diào)。因此，作者對(duì)LDHA在肌肉形成中的能量代謝調(diào)節(jié)作用做了進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。研究表明，LDHA可促進(jìn)糖酵解和三羧酸（TCA）循環(huán)，通過(guò)增強(qiáng)檸檬酸（NADH）循環(huán)抑制電子傳遞鏈（ETC）氧化磷酸化，進(jìn)而提供促成肌細(xì)胞分化的中間代謝物。此外，LDHA也促進(jìn)了糖酵解過(guò)程中Akt磷酸化，激活PI3K-Akt通路誘導(dǎo)肌細(xì)胞分化。因此作者發(fā)現(xiàn)了LDHA在調(diào)節(jié)骨骼肌生成中的新機(jī)制，即通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞輔酶Ⅰ（NAD+）水平進(jìn)而影響成肌細(xì)胞分化和線粒體功能。

圖1：雞肌肉抗體陣列的構(gòu)建

（A）雞肌肉抗體陣列構(gòu)建工作流程概述.（B）部分樣品的SDS-PAGE蛋白豐度分析，銀染顯色(左)，用Image J分析每個(gè)樣品每個(gè)條帶的蛋白豐度(右)，所有單條帶的豐度值不超過(guò)每個(gè)蛋白總豐度值的30%。Lane1 -9代表:100日齡興化雞(XH)骨骼肌，100日齡隱性白普利茅斯巖雞骨骼肌，1日齡XH骨骼肌，18胚齡XH骨骼肌.（C）3只免疫小鼠的血清抗體采用SAS-PAGE和銀染進(jìn)行分析，結(jié)果顯示小鼠1具有最強(qiáng)的免疫應(yīng)答和最高的抗體多樣性。Lane1-3表示小鼠1血清分別稀釋1000倍、2000倍、5000倍；Lane 5-7表示:小鼠2血清分別稀釋1000倍、2000倍、5000倍；Lane9-11表示:小鼠3血清分別稀釋1000倍、2000倍、5000倍.（D）ELISA評(píng)估三種免疫小鼠的血清抗體效價(jià).（E）Elisa對(duì)隨機(jī)選取的188株細(xì)胞株上清液進(jìn)行價(jià)態(tài)測(cè)定.

作者通過(guò)首個(gè)家雞肌肉的抗體陣列，對(duì)成肌細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中涉及的蛋白譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了能量代謝在增殖到分化轉(zhuǎn)變中的關(guān)鍵作用。能量代謝相關(guān)蛋白LDHA進(jìn)一步被證實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌的糖酵解和線粒體能量代謝過(guò)程，影響成肌細(xì)胞的增殖和分化。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.127629

Arrayjet位于英國(guó)愛(ài)丁堡，專(zhuān)注于提供生物芯片應(yīng)用領(lǐng)域的解決方案及服務(wù)。自2000年公司成立即致力于開(kāi)發(fā)新型生物樣品噴點(diǎn)方案–噴墨式液體處理平臺(tái)，該系統(tǒng)于2006年上市，目前用戶(hù)遍布全球27個(gè)國(guó)家。

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