Tankyrase抑制劑對人關(guān)節(jié)軟骨細胞中蛋白酶表達的抑制作用
骨關(guān)節(jié)炎（OA）是最常見的關(guān)節(jié)疾病，OA 的一個特征是關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和損傷之間的不平衡，其涉及復(fù)雜的炎癥和代謝因素。盡管在正常軟骨細胞中，軟骨分化和細胞外基質(zhì)（ECM）合成代謝促進了軟骨修復(fù)，但這些功能在 OA 軟骨中降低。SRY-box9（SOX9）已被確定為發(fā)育中軟骨生成的主要轉(zhuǎn)錄因子，并通過調(diào)節(jié) II 型膠原（COL2A1）和聚集蛋白聚糖（ACAN）來控制 ECM 穩(wěn)態(tài)。然而，OA 軟骨中 SOX9 活性也被下調(diào)，導(dǎo)致 ECM 合成代謝降低。另一方面，過度的機械應(yīng)力參與軟骨損傷并激活各種炎癥途徑，如 IL-1β、TNF-α、NF-κB、Wnt、TGF-β 和 microRNA 通路以及氧化應(yīng)激。過度的機械應(yīng)力與 OA 有關(guān)，并影響軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨細胞的功能。盡管對 OA 的發(fā)病機制有這些見解，但目前對 OA 尚無根治性治療方法。
最近有報道稱，端錨聚合酶 Tankyrases（TNKS-1和TNKS-2）是改善病情的骨關(guān)節(jié)炎藥物（DMOADs）的潛在靶點。TNKS-1/2 屬于聚（ADP-ribose）聚合酶（PARP）超家族，參與各種細胞和分子過程。PARPs 通過翻譯后修飾將 ADP-核糖基團轉(zhuǎn)移至靶蛋白，包括多聚ADP-核糖基化修飾（PARylation）。研究表明，TNKS-1/2 介導(dǎo)的 SOX9 的 PARylation 在調(diào)節(jié) SOX9 泛素化和降解中起著至關(guān)重要的作用，TNKS-1/2 抑制劑在小鼠 OA 模型中具有軟骨保護作用。然而，TNKS-1/2 參與人軟骨細胞 OA 發(fā)病機制的作用以及 TNKS-1/2 抑制劑在機械應(yīng)力模型中的軟骨保護作用機制仍然知之甚少。
最近，在日本岡山大學(xué)醫(yī)齒藥學(xué)綜合研究科、岡山大學(xué)附屬病院骨科課題團隊的一項研究中，旨在闡明 TNKS-1/2 在 OA 發(fā)病機制中的參與，并探討 TNKS-1/2 抑制劑對機械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨退變的影響。研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Inhibitory Effect of a Tankyrase Inhibitor on Mechanical Stress-Induced Protease Expression in Human Articular Chondrocytes”。
首先，實驗檢測了單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變 CTS 刺激（0.5 Hz，10% 伸長率）對正常人軟骨細胞的影響。CTS 持續(xù) 12h 后，COL2A1、ACAN 和 SOX9 mRNA 水平下降，TNKS-1/2 水平以及 ADAMTS-5 和 MMP-13 水平顯著升高。RT-PCR 結(jié)果顯示，當 CTS 條件更換為 0.5 Hz，8% 伸長率，30min 時抑制合成代謝反應(yīng)并促進分解代謝反應(yīng)，此外，TNKS-1/2 水平在 12h 后上調(diào)了 3 倍多。因此，隨后使用 8% 伸長率進行實驗。
然后研究 XAV939（一種 Tankyrase 抑制劑）對 CTS 后 SOX9、COL2A1、ACAN、TNKS-1/2、MMP-13 和 ADAMTS-5 表達水平的影響。XAV939 的濃度確定為 10μM（圖1 A），發(fā)現(xiàn) CTS 后 12h，SOX9、COL2A1 和 ACAN 表達水平被 CTS 降低，而這些降低被 XAV939 阻斷。在無 CTS 的情況下，受 XAV939 的影響，其表達水平有升高的趨勢（圖1 B）。在合成代謝反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn) XAV939 消除了 CTS 引起的合成代謝抑制。CTS 后 MMP-13 和 ADAMTS-5 的上調(diào)被 XAV939 消除（圖1 C）。這表明，XAV939 抑制人軟骨細胞的分解代謝作用并促進合成代謝作用。然而，與未加 XAV939 相比，添加 XAV939 的細胞經(jīng)歷 CTS 后 TNKS-1/2 的表達沒有顯著降低（圖1 D）。在未添加 XAV939 的樣本中，CTS 后培養(yǎng)基中 IL-1β 的濃度呈時間依賴性增加，CTS 聯(lián)合 XAV939 處理后 24h IL-1β 的上調(diào)顯著降低（圖1 E）。
圖1 TNKS-1/2抑制劑XAV939對CTS誘導(dǎo)的正常人軟骨細胞基因表達及上清液中IL-1β濃度的影響。
如前所述，機械應(yīng)力會激活應(yīng)激反應(yīng)信號通路 MAPK。接下來，在CTS 30min 后，在存在和不存在 XAV939 下檢測了 MAPK（ERK、p38 和 JNK）的磷酸化。結(jié)果表明，與未拉伸組相比，CTS 顯著增加了 p38 和 JNK 磷酸化。與對照組相比，ERK2 的磷酸化顯著，但 ERK1 沒有磷酸化。Western blot 分析顯示，XAV939 未抑制 CTS 誘導(dǎo)的 MAPK 磷酸化。
ADAMTS-5 和 MMP-13 表達均在無 XAV939 的 CTS 后上調(diào)并定位于細胞質(zhì)中，而用 XAV939 處理后表達下調(diào)（圖2 A）。ADAMTS-5 和 MMP-13 陽性軟骨細胞的百分比通過 XAV939 處理后顯著降低（圖2 B）。這些結(jié)果表明，XAV939 抑制了 CTS 誘導(dǎo)的 ADAMTS-5 和 MMP-13 表達（圖2 C）。
免疫細胞化學(xué)顯示，CTS 誘導(dǎo) NF-κB p65 和 β-catenin 易位至細胞核，但這在 XAV939 處理的細胞中被抑制。XAV939 處理后，NF-κB p65 和 β-catenin 核易位陽性的軟骨細胞百分比顯著降低。細胞核提取蛋白的 Western blot 分析結(jié)果也表明，XAV939 抑制 CTS 誘導(dǎo)的 NF-κB p65 和 β-catenin 蛋白表達水平。這表明，Wnt/β-catenin 信號激活也發(fā)生在機械應(yīng)力模型中。
圖2 TNKS-1/2抑制劑XAV939抑制CTS誘導(dǎo)的正常人軟骨細胞中ADAMTS-5和MMP-13蛋白的表達。
免疫細胞化學(xué)顯示，CTS 后 NF-κB p65 和 β-catenin 同時向細胞核易位，XAV939 可阻斷這種作用。XAV939 處理后，NF-κB p65 和 β-catenin 核易位的軟骨細胞百分比顯著降低。在沒有 XAV939 的 CTS 樣本中，NF-κB p65 易位到細胞核的所有細胞也顯示出 β-catenin 的核易位。這一結(jié)果表明，NF-κB 和 β-catenin 核易位相互作用，可能影響隨后的蛋白酶表達。
最后，研究人員使用患者的18份 OA 軟骨樣本進行免疫組織化學(xué)染色，以評估 TNKS-1/2 在關(guān)節(jié)軟骨中的表達。使用 Mankin 評分評估軟骨損傷程度，在軟骨退變較低的樣本中，TNKS-1/2 很少在每層中表達。在輕度退變的患者中，表層 TNKS-1/2 的表達相對于中層和深層顯著增加。在中等退變軟骨中，與表層相比，中層和深層的 TNKS-1/2 表達顯著增加。盡管與其他等級相比有所下降，但 TNKS-1/2 在重度退變軟骨的中層或深層也有表達（圖3 A、B）。這表明，TNKS-1/2 在輕度退變的表層中表達明顯高于其他層，在中度退變的深層中表達明顯高于表層（圖3 C）。
總之，該研究證明了 TNKS-1/2 作為體外正常人軟骨細胞機械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨退變因素的重要性。數(shù)據(jù)表明，機械刺激上調(diào)了 TNKS-1/2 的表達，并且通過激活 Wnt/β-catenin 信號，β-catenin 的核易位可能會增強 NF-κB-IL-1β 信號傳導(dǎo)，從而產(chǎn)生 ADAMTS-5 和 MMP-13。研究還發(fā)現(xiàn)，TNKS-1/2 抑制劑 XAV939 的干預(yù)抑制了這些途徑并促進了合成代謝反應(yīng)。在人 OA 軟骨中，與較低和重度 OA 軟骨相比，TNKS-1/2 在輕度和中度 OA 軟骨中表達更頻繁。這些結(jié)果提示，TNKS-1/2 可能是 OA 的分子治療靶點和診斷標志物。
參考文獻：Hotta Y, Nishida K, Yoshida A, Nasu Y, Nakahara R, Naniwa S, Shimizu N, Ichikawa C, Lin D, Fujiwara T, Ozaki T. Inhibitory Effect of a Tankyrase Inhibitor on Mechanical Stress-Induced Protease Expression in Human Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2024 Jan 24;25(3):1443. doi: 10.3390/ijms25031443. PMID: 38338721; PMCID: PMC10855100.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38338721/
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
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最近有報道稱，端錨聚合酶 Tankyrases（TNKS-1和TNKS-2）是改善病情的骨關(guān)節(jié)炎藥物（DMOADs）的潛在靶點。TNKS-1/2 屬于聚（ADP-ribose）聚合酶（PARP）超家族，參與各種細胞和分子過程。PARPs 通過翻譯后修飾將 ADP-核糖基團轉(zhuǎn)移至靶蛋白，包括多聚ADP-核糖基化修飾（PARylation）。研究表明，TNKS-1/2 介導(dǎo)的 SOX9 的 PARylation 在調(diào)節(jié) SOX9 泛素化和降解中起著至關(guān)重要的作用，TNKS-1/2 抑制劑在小鼠 OA 模型中具有軟骨保護作用。然而，TNKS-1/2 參與人軟骨細胞 OA 發(fā)病機制的作用以及 TNKS-1/2 抑制劑在機械應(yīng)力模型中的軟骨保護作用機制仍然知之甚少。
最近，在日本岡山大學(xué)醫(yī)齒藥學(xué)綜合研究科、岡山大學(xué)附屬病院骨科課題團隊的一項研究中，旨在闡明 TNKS-1/2 在 OA 發(fā)病機制中的參與，并探討 TNKS-1/2 抑制劑對機械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨退變的影響。研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Inhibitory Effect of a Tankyrase Inhibitor on Mechanical Stress-Induced Protease Expression in Human Articular Chondrocytes”。
首先，實驗檢測了單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變 CTS 刺激（0.5 Hz，10% 伸長率）對正常人軟骨細胞的影響。CTS 持續(xù) 12h 后，COL2A1、ACAN 和 SOX9 mRNA 水平下降，TNKS-1/2 水平以及 ADAMTS-5 和 MMP-13 水平顯著升高。RT-PCR 結(jié)果顯示，當 CTS 條件更換為 0.5 Hz，8% 伸長率，30min 時抑制合成代謝反應(yīng)并促進分解代謝反應(yīng)，此外，TNKS-1/2 水平在 12h 后上調(diào)了 3 倍多。因此，隨后使用 8% 伸長率進行實驗。
然后研究 XAV939（一種 Tankyrase 抑制劑）對 CTS 后 SOX9、COL2A1、ACAN、TNKS-1/2、MMP-13 和 ADAMTS-5 表達水平的影響。XAV939 的濃度確定為 10μM（圖1 A），發(fā)現(xiàn) CTS 后 12h，SOX9、COL2A1 和 ACAN 表達水平被 CTS 降低，而這些降低被 XAV939 阻斷。在無 CTS 的情況下，受 XAV939 的影響，其表達水平有升高的趨勢（圖1 B）。在合成代謝反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn) XAV939 消除了 CTS 引起的合成代謝抑制。CTS 后 MMP-13 和 ADAMTS-5 的上調(diào)被 XAV939 消除（圖1 C）。這表明，XAV939 抑制人軟骨細胞的分解代謝作用并促進合成代謝作用。然而，與未加 XAV939 相比，添加 XAV939 的細胞經(jīng)歷 CTS 后 TNKS-1/2 的表達沒有顯著降低（圖1 D）。在未添加 XAV939 的樣本中，CTS 后培養(yǎng)基中 IL-1β 的濃度呈時間依賴性增加，CTS 聯(lián)合 XAV939 處理后 24h IL-1β 的上調(diào)顯著降低（圖1 E）。
如前所述，機械應(yīng)力會激活應(yīng)激反應(yīng)信號通路 MAPK。接下來，在CTS 30min 后，在存在和不存在 XAV939 下檢測了 MAPK（ERK、p38 和 JNK）的磷酸化。結(jié)果表明，與未拉伸組相比，CTS 顯著增加了 p38 和 JNK 磷酸化。與對照組相比，ERK2 的磷酸化顯著，但 ERK1 沒有磷酸化。Western blot 分析顯示，XAV939 未抑制 CTS 誘導(dǎo)的 MAPK 磷酸化。
ADAMTS-5 和 MMP-13 表達均在無 XAV939 的 CTS 后上調(diào)并定位于細胞質(zhì)中，而用 XAV939 處理后表達下調(diào)（圖2 A）。ADAMTS-5 和 MMP-13 陽性軟骨細胞的百分比通過 XAV939 處理后顯著降低（圖2 B）。這些結(jié)果表明，XAV939 抑制了 CTS 誘導(dǎo)的 ADAMTS-5 和 MMP-13 表達（圖2 C）。
免疫細胞化學(xué)顯示，CTS 誘導(dǎo) NF-κB p65 和 β-catenin 易位至細胞核，但這在 XAV939 處理的細胞中被抑制。XAV939 處理后，NF-κB p65 和 β-catenin 核易位陽性的軟骨細胞百分比顯著降低。細胞核提取蛋白的 Western blot 分析結(jié)果也表明，XAV939 抑制 CTS 誘導(dǎo)的 NF-κB p65 和 β-catenin 蛋白表達水平。這表明，Wnt/β-catenin 信號激活也發(fā)生在機械應(yīng)力模型中。
免疫細胞化學(xué)顯示，CTS 后 NF-κB p65 和 β-catenin 同時向細胞核易位，XAV939 可阻斷這種作用。XAV939 處理后，NF-κB p65 和 β-catenin 核易位的軟骨細胞百分比顯著降低。在沒有 XAV939 的 CTS 樣本中，NF-κB p65 易位到細胞核的所有細胞也顯示出 β-catenin 的核易位。這一結(jié)果表明，NF-κB 和 β-catenin 核易位相互作用，可能影響隨后的蛋白酶表達。
最后，研究人員使用患者的18份 OA 軟骨樣本進行免疫組織化學(xué)染色，以評估 TNKS-1/2 在關(guān)節(jié)軟骨中的表達。使用 Mankin 評分評估軟骨損傷程度，在軟骨退變較低的樣本中，TNKS-1/2 很少在每層中表達。在輕度退變的患者中，表層 TNKS-1/2 的表達相對于中層和深層顯著增加。在中等退變軟骨中，與表層相比，中層和深層的 TNKS-1/2 表達顯著增加。盡管與其他等級相比有所下降，但 TNKS-1/2 在重度退變軟骨的中層或深層也有表達（圖3 A、B）。這表明，TNKS-1/2 在輕度退變的表層中表達明顯高于其他層，在中度退變的深層中表達明顯高于表層（圖3 C）。
圖3 TNKS-1/2在人關(guān)節(jié)軟骨組織中的免疫組化評估。
總之，該研究證明了 TNKS-1/2 作為體外正常人軟骨細胞機械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨退變因素的重要性。數(shù)據(jù)表明，機械刺激上調(diào)了 TNKS-1/2 的表達，并且通過激活 Wnt/β-catenin 信號，β-catenin 的核易位可能會增強 NF-κB-IL-1β 信號傳導(dǎo)，從而產(chǎn)生 ADAMTS-5 和 MMP-13。研究還發(fā)現(xiàn)，TNKS-1/2 抑制劑 XAV939 的干預(yù)抑制了這些途徑并促進了合成代謝反應(yīng)。在人 OA 軟骨中，與較低和重度 OA 軟骨相比，TNKS-1/2 在輕度和中度 OA 軟骨中表達更頻繁。這些結(jié)果提示，TNKS-1/2 可能是 OA 的分子治療靶點和診斷標志物。
參考文獻：Hotta Y, Nishida K, Yoshida A, Nasu Y, Nakahara R, Naniwa S, Shimizu N, Ichikawa C, Lin D, Fujiwara T, Ozaki T. Inhibitory Effect of a Tankyrase Inhibitor on Mechanical Stress-Induced Protease Expression in Human Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2024 Jan 24;25(3):1443. doi: 10.3390/ijms25031443. PMID: 38338721; PMCID: PMC10855100.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38338721/
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進展。如有侵權(quán)或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注!進入官網(wǎng)www.naturethink.com或關(guān)注"Naturethink"公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。
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