懸浮細(xì)胞的電融合實(shí)驗(yàn)步驟

懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的電融合
融合懸浮細(xì)胞的步驟與電穿孔的很類(lèi)似，只是在進(jìn)行高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖前后，必須用低幅、高頻電場(chǎng)使細(xì)胞排成一條鏈。
1 用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細(xì)胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細(xì)胞時(shí)，在臺(tái)式離心機(jī)上1000rpm下離心3分鐘，得到細(xì)胞沉淀，棄去上清液將細(xì)胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。
2 將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細(xì)胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分混合。
3 啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以?xún)?nèi)，用顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞是否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達(dá)到最佳效果。
4 讓介電電泳場(chǎng)開(kāi)約1分鐘后關(guān)掉，立即應(yīng)用融合脈沖，其振幅數(shù)量級(jí)為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進(jìn)行融合脈沖后立即再次啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，常規(guī)讓其開(kāi)啟約2分鐘。
5 關(guān)掉介電電泳場(chǎng)，讓細(xì)胞在樣品池中靜置10分鐘。
6 去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細(xì)胞。
7 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱一般條件下培養(yǎng)。

[注意事項(xiàng)]
1 最優(yōu)組分依使用的特定細(xì)胞種類(lèi)而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意，就應(yīng)嘗試改變穿孔介質(zhì)。
2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，為達(dá)到最高效率，必須收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞。
1.純化siRNA
在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性
通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。
4.避免使用抗生素
抗生素會(huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。
5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑
針對(duì)siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類(lèi)型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
 6.通過(guò)合適的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件
對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)照。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過(guò)多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。
7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
熒光標(biāo)記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來(lái)追蹤轉(zhuǎn)染過(guò)程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來(lái)。