熒光顯微鏡應(yīng)用于病毒學(xué)研究

瀏覽次數(shù)：699　發(fā)布日期：2024-4-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、病毒

病毒是一種個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單，只含一種核酸（DNA或RNA），需要在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型生物。病毒是一種非細(xì)胞生命形態(tài)，它由一個(gè)核酸長鏈和蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成，病毒沒有自己的代謝機(jī)構(gòu)，沒有酶系統(tǒng)。因此病毒離開了宿主細(xì)胞，就成了沒有任何生命活動、也不能獨(dú)立自我繁殖的化學(xué)物質(zhì)。它的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的能力都是在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，當(dāng)它進(jìn)入宿主細(xì)胞后，它就可以利用細(xì)胞中的物質(zhì)和能量完成生命活動，按照它自己的核酸所包含的遺傳信息產(chǎn)生和它一樣的新一代病毒。

流感病毒渲染圖

二、光學(xué)顯微鏡在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用

相比于常見細(xì)胞的幾十微米級別尺寸，病毒的尺寸小很多，一般在60-220nm，而受制于可見光的衍射峰值，光學(xué)顯微鏡無法分辨200nm以下的物體，因此無法對病毒進(jìn)行結(jié)構(gòu)尺度的觀測，目前應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對病毒進(jìn)行觀測研究主要是從以下兩個(gè)方面著手：

（1）通過觀測對病毒進(jìn)行特異性標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)對病毒位置數(shù)量的判斷。病毒主要由核酸和蛋白質(zhì)組成，常見的一種方法是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與病毒含有的靶DNA分子或RNA分子進(jìn)行雜交，可通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的病毒的分布和數(shù)量，這種方式也稱為原位熒光雜交技術(shù)（FISH）。

FISH做的病毒檢測，紅色為病毒外殼蛋白
（引自公開論文https://doi.org/10.1073/pnas.1820132117）

（2）通過檢測病毒入侵導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的免疫物質(zhì)或病理形態(tài)變化，從而判斷病毒種類、分布和數(shù)量。正常細(xì)胞在面對病毒入侵時(shí)，會發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的免疫物質(zhì)就可作為熒光染料標(biāo)記的結(jié)合物，通過熒光顯微鏡對免疫熒光信號進(jìn)行觀測從而做出檢測判斷，這種通過對免疫蛋白進(jìn)行標(biāo)記的方式也稱之為免疫熒光（IF），這種方式在臨床上常見的應(yīng)用有呼吸道七聯(lián)檢或九聯(lián)檢。

呼吸道七聯(lián)檢免疫熒光，MF31拍攝（綠色為病毒反應(yīng)）

應(yīng)用類似原理，還有不使用熒光染色的免疫組化(IHC)染色，主要用于尸檢研究，判斷病毒對身體各器官的感染情況，比如新冠病毒和猴痘病毒都能找到相關(guān)研究。

IHC免疫組化染色，猴痘病毒感染犬的支氣管（紅色為病毒反應(yīng)）

病毒入侵也會導(dǎo)致細(xì)胞或組織發(fā)生病理變化，如感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞的胞漿膜發(fā)生融合，形成多核的巨細(xì)胞，或某些病毒感染細(xì)胞時(shí)，在光學(xué)明場顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸或嗜堿性染色、大小不同和數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，如HPV人乳頭狀瘤病毒。

HPV引起，分化不良的鱗狀細(xì)胞癌

三、顯微成像技術(shù)在病毒觀測中的挑戰(zhàn)

根據(jù)上述光學(xué)顯微鏡對病毒的檢測方式，主要有兩種方式，一是使用熒光顯微鏡檢測熒光染料標(biāo)記病毒本身的熒光信號或入侵細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體物質(zhì)熒光信號，二是使用明場方式觀測IHC或者HE染色的細(xì)胞或組織的病理形態(tài)。

主要的挑戰(zhàn)來自病毒本身體積小，含量相對較低，導(dǎo)致熒光染料產(chǎn)生的熒光信號弱，需要使用較強(qiáng)的激發(fā)光與高靈敏度的顯微相機(jī)進(jìn)行成像；使用免疫熒光方式檢測病毒對特異性染料的選擇及熒光顯微鏡濾光片的選擇要求較高，需要保證病毒標(biāo)志物熒光信號不被其它種類的熒光信號所覆蓋，對通道的選擇及熒光圖像軟件的合成有很高的要求。