細(xì)胞因子IL-33聯(lián)合治療提供胃癌腹膜轉(zhuǎn)移治療新思路

胃癌是全球第六大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。全球每年新確診胃癌病例達(dá)100萬，死亡病例約為80萬。腹膜轉(zhuǎn)移（PM）是胃癌患者最常見的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移形式。大約53-66%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性胃癌患者伴有腹膜轉(zhuǎn)移，其五年生存率僅為6.0%。對于這些患者來說，常用的治療措施效果不理想，而抑制性腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）限制了免疫治療的效果。

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院魏嘉教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊近日發(fā)現(xiàn)，腹腔注射IL-33可以誘導(dǎo)腹腔炎癥環(huán)境，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，從而延緩胃癌進(jìn)展和腹膜轉(zhuǎn)移。

這項題為“Macrophages reprogramming improves immunotherapy of IL-33 in peritoneal metastasis of gastric cancer”的研究成果于2024年1月發(fā)表在《EMBO Molecular Medicine》雜志上，為治療轉(zhuǎn)移性腹膜惡性腫瘤提供了一種大有前景的新方法。
 

圖片來源：《EMBO Molecular Medicine》
（https://doi.org/10.1038/s44321-023-00012-y）

研究材料與方法
在本研究中，研究人員將小鼠前胃癌（MFC）細(xì)胞注射到615系小鼠體內(nèi)，構(gòu)建腹膜散播性腫瘤模型，并利用IL-33來治療。他們比較了腫瘤大小、免疫細(xì)胞的豐度和促炎細(xì)胞因子的水平。之后，他們對小鼠腫瘤開展RNA測序分析，以篩選關(guān)鍵基因和通路。他們還通過體內(nèi)和體外分析確定了IL-33對巨噬細(xì)胞極化的影響。在評估IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用的效果時，研究人員委托賽業(yè)生物設(shè)計了熒光素酶報告基因的慢病毒載體，并用它來感染MFC細(xì)胞。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建腹膜散播性腫瘤小鼠模型，評估IL-33的治療效果和免疫環(huán)境
02 對小鼠腫瘤開展RNA測序分析，篩選關(guān)鍵的基因和通路
03 通過體外和體內(nèi)實驗評估IL-33對巨噬細(xì)胞極化的影響，并確定其作用機(jī)制
04 在多個模型中評估IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑聯(lián)用的抗腫瘤效果

研究結(jié)果
1 IL-33延緩胃癌小鼠模型的腫瘤生長
白細(xì)胞介素-33（IL-33）是IL-1超家族中的一個重要成員，以往的研究表明這種細(xì)胞因子能增強(qiáng)抗腫瘤免疫力并抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。于是，研究團(tuán)隊決定嘗試腹腔局部注射IL-33，以激活腫瘤免疫微環(huán)境并增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。

首先，研究人員評估了IL-33 mRNA在正常組織、腫瘤組織及惡性腹水的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腹水腫瘤細(xì)胞中的IL-33 mRNA表達(dá)量下降。此外，與IL-33 mRNA低表達(dá)的胃癌患者相比，高表達(dá)的胃癌患者的中位總生存期和中位無進(jìn)展生存期明顯延長。

基于此，他們進(jìn)一步評估了IL-33在腹腔散播性腫瘤中的作用。他們在615系小鼠體內(nèi)注射經(jīng)過慢病毒感染的MFC細(xì)胞（慢病毒由賽業(yè)生物提供），構(gòu)建了腹膜散播性腫瘤模型，然后用mIL-33或PBS來處理小鼠。他們發(fā)現(xiàn)，IL-33治療組的腹腔散播性腫瘤和腸系膜散播性腫瘤顯著減少，腫瘤重量也有所減輕（圖1）。與對照組小鼠相比，IL-33治療組小鼠的中位生存期延長。這些結(jié)果表明，IL-33的局部腹腔注射能夠有效觸發(fā)腹腔散播性胃癌的抗腫瘤效應(yīng)。
 

IL-33可延緩腫瘤生長，促進(jìn)腹膜免疫細(xì)胞的浸潤和激活，并誘導(dǎo)局部炎癥環(huán)境^[1]

同時，研究人員在治療終點收集小鼠腫瘤和脾臟并開展流式分析，以評估IL-33對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。與對照組相比，IL-33治療組的腹腔腫瘤中的CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞浸潤顯著增加，但M1型巨噬細(xì)胞無顯著差異。免疫細(xì)胞中的IFN-γ水平也提高（圖1），表明IL-33激活了免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用。

此外，IL-33處理組的促炎細(xì)胞因子水平升高，表明它可誘導(dǎo)局部炎癥環(huán)境。之后，他們對小鼠腫瘤進(jìn)行了RNA測序分析。GO和KEGG分析顯示，IL-33治療組小鼠的差異基因明顯集中在吞噬相關(guān)通路和免疫反應(yīng)通路�；�因集富集分析（GSEA）也表明，吞噬識別、T細(xì)胞活化、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和NF-κB信號通路在實驗組中富集。這些數(shù)據(jù)證明了IL-33介導(dǎo)的局部炎癥環(huán)境誘導(dǎo)了腹腔巨噬細(xì)胞的招募和腫瘤免疫環(huán)境的激活。

2 IL-33誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2極化
為了進(jìn)一步評估IL-33對巨噬細(xì)胞表型和功能的影響，研究人員利用小鼠和人類的巨噬細(xì)胞開展體外實驗。小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7經(jīng)過IL-33處理后，CD80和iNOS（M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)率增加，而CD163和CD206（M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)也上調(diào)。這些結(jié)果表明，IL-33在體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞同時向M1和M2表型極化，這與體內(nèi)觀察到的結(jié)果不完全一致。研究人員推測，腹腔腫瘤免疫微環(huán)境處于一種高度免疫抑制的狀態(tài)，多個免疫抑制細(xì)胞因子和趨化因子高度表達(dá)，導(dǎo)致IL-33在體內(nèi)無法誘導(dǎo)M1極化。

之后，為了探究IL-33誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，研究人員對IL-33的關(guān)鍵下游信號通路開展分析，包括NF-κB p65、p44/42 MAPK和p38。通過采用相關(guān)通路的抑制劑，他們發(fā)現(xiàn)NF-κB p65和p44/42 MAPK信號通路在巨噬細(xì)胞的M1極化中起作用。當(dāng)這些通路被抑制時，巨噬細(xì)胞傾向于發(fā)生M2極化。相反，激活p38信號通路可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，IL-33能夠通過p38依賴的機(jī)制增強(qiáng)GATA結(jié)合蛋白3（GATA3）的表達(dá)。在本研究中，他們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過IL-33刺激的RAW264.7細(xì)胞中，GATA3水平顯著升高，而在加入p38抑制劑（SB203580）后，GATA3表達(dá)水平下降。在利用shRNA敲降GATA3后，CD163表達(dá)顯著下降，這表明GATA3在IL-33誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞重編程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3 IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑聯(lián)用可增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)
最后，研究人員在多個模型中研究了IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用的抗腫瘤策略，CSF1R抗體可減少腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的數(shù)量，促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化的重編程。體內(nèi)生物發(fā)光成像（BLI）顯示，與單藥治療組相比，IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用可有效抑制熒光素酶介導(dǎo)的MFC細(xì)胞的腹腔擴(kuò)散。聯(lián)合治療組的腫瘤數(shù)量顯著減少，凸顯了進(jìn)一步的抗腫瘤效果（圖2）。后續(xù)分析顯示，IL-33能引發(fā)M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的聚集，而IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用能增強(qiáng)腹腔散播性胃癌的抗腫瘤反應(yīng)。
 

IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用可增強(qiáng)小鼠模型的抗腫瘤反應(yīng)^[1]

同樣地，他們還評估了IL-33與p38抑制劑聯(lián)用的治療效果。與單藥治療組相比，聯(lián)合治療使得小鼠腹腔腫瘤重量顯著減輕，且腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少。結(jié)合后續(xù)分析，他們發(fā)現(xiàn)抑制p38信號通路可將巨噬細(xì)胞從M2表型重編程為M1表型。因此，IL-33與p38抑制劑聯(lián)用可協(xié)同增強(qiáng)腹腔散播性胃癌的抗腫瘤反應(yīng)。

研究結(jié)論

IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑聯(lián)用發(fā)揮抗腫瘤作用的示意圖^[1]

總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，IL-33可驅(qū)動免疫效應(yīng)細(xì)胞的招募和活化，促進(jìn)抗腫瘤促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，將腫瘤微環(huán)境從免疫抑制狀態(tài)重編程為免疫激活狀態(tài)，抑制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。不過，IL-33也會通過p38-GATA3信號通路誘導(dǎo)M2極化，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和炎癥消退。因此，IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑的聯(lián)用可以避免IL-33誘導(dǎo)的M2極化，具有協(xié)同抗腫瘤作用。

參考文獻(xiàn)：
[1]Che K, Luo Y, Song X, Yang Z, Wang H, Shi T, Wang Y, Wang X, Wu H, Yu L, Liu B, Wei J. Macrophages reprogramming improves immunotherapy of IL-33 in peritoneal metastasis of gastric cancer. EMBO Mol Med. 2024 Feb;16(2):251-266. https://doi.org/10.1038/s44321-023-00012-y