用于組織工程支架血管化的微管嵌入水凝膠生物打印

摘要
血管組織工程被認為是有前途的可行的人造組織和器官的替代方案之一。采 用各種技術(shù)制造的宏觀和微觀空心管已被廣泛研究以模擬血管。迄今為止，尺寸從 1 微米到 10 微米的仿生毛細血管的制造仍然具有挑戰(zhàn)性。在本文中 , 通過靜電紡絲來模擬毛細血管，并將芯鞘微管嵌入羧甲基纖維素/海藻酸鈉水凝膠中進行生物打印。結(jié)果顯示打印保真度得到改善并促進細胞附著。 管濃度和管長度對細絲尺寸和合并面積都有顯著影響。具有較高微管濃度的 打印組表現(xiàn)出較高的微管密度，燈絲/噴嘴尺寸比以及打印/設(shè)計的網(wǎng)格面積 比接近100%。在體外實驗中，微管不僅與人臍靜脈內(nèi)皮細胞相容，而且還提 供了微地形線索， 以促進三維空間中的細胞增殖和形態(tài)發(fā)生�？傊�，我們小 組制造的微管具有用于血管化軟組織支架生物打印的潛力。

關(guān)鍵詞
生物打印，芯鞘靜電紡絲，水凝膠，微管，血管組織工程

1 引言
心血管疾�。–VD）是全球死亡的主要原因（世界衛(wèi)生組織，2022    ) 。盡管自體血管移植被認為是臨床治療的金標準，但傳統(tǒng)的移植方  法受到供體數(shù)量的限制，可能會導致繼發(fā)性血管阻塞(Kucukgul et al. , 2015; Pashneh-Tala et al., 2016)。血管組織工程的發(fā)展為心血管 疾病帶來了新的治療方向。通過用合成移植物替換殘疾血管，可以重  建血管系統(tǒng)，并可以繞過閉塞和動脈瘤（Song et al., 2018）。大直 徑（>8mm）和中直徑（6-8mm）的合成移植物主要通過成型和生物 打印來模擬血管網(wǎng)絡(luò)來制造（Fazal et al., 2021）。然而，傳統(tǒng)的制 造方法通常無法制造尺寸為亞10微米級別的毛細管擬態(tài)和生物相容性 微血管系統(tǒng)。

近年來引入靜電紡絲來制造毛細血管（Zhou et al., 2018）。通過 向液滴施加高電壓，靜電斥力抵消表面張力并拉伸液滴。一旦排斥 力克服了表面張力，泰勒錐就會形成并導致噴發(fā)（Kong et al.,2010）。借助靜電紡絲技術(shù)，可以制造微米到納米級的纖維。在  我們之前的研究中，開發(fā)了芯鞘靜電紡絲以獲得模擬毛細血管的管  狀結(jié)構(gòu)（Zhou & Tan ，2020a）。將兩種靜電紡絲溶液同時泵入  芯鞘噴絲頭，隨后芯溶液溶解（Zhou et al., 2021）。在另一個例 子中，吳等人。 (2020) 使用芯鞘靜電紡絲來制造聚乳酸-乙醇酸  共聚物和聚乳酸的混合纖維， 以促進機械完整性、細胞附著和增殖  。盡管越來越多的研究致力于推進靜電紡絲在血管組織工程中的應(yīng)  用，但由于靜電紡絲的固有性質(zhì)，許多工作都集中在沒有宏觀形態(tài)  控制的二維（2D）支架的制造上。為了解決這個問題，最新的研究 一直集中在增材制造技術(shù)上，例如用于制造人造血管的生物打印。

生物打印通常用于打印合成軟組織并為細胞生長提供細胞外基質(zhì)環(huán)境 （Huang et al., 2021）。人們已經(jīng)做出了許多努力來使用生物打印 技術(shù)來制造血管模擬物，該技術(shù)可以提供均勻的細胞負載生物墨水。 例如，徐等人。（2018）利用雙層圓形支撐支架和生物打印的小直 徑血管替代品。弗里曼等人。(2019) 將纖維蛋白原與明膠混合，在 旋轉(zhuǎn)收集器上打印血管結(jié)構(gòu)。關(guān)于生物打印材料，海藻酸鈉（SA） 由 于其生物相容性、生物可降解性以及對二價抗衡離子的快速交聯(lián)反應(yīng) , 是細胞培養(yǎng)中使用最廣泛的生物打印材料之一（Asadi et al.,2020）。另一方面， 由于其流體特性，純 SA 溶液的打印通常會導  致打印保真度和結(jié)構(gòu)完整性較差。此外，細胞親和力的缺乏導致細胞 附著和增殖低。為了解決這些問題，研究人員將SA與其他生物材料混 合，例如凝膠（Mondal等，2019）、膠原蛋白（Yang等，2018）和羧甲基纖維素（CMC）（Zhang等，2021）， 以改善機械性能特  性并最大限度地減少生物惰性（Sun & Tan ，2013）。此外，靜電紡 絲與生物打印的結(jié)合在血管組織工程中顯示出日益增長的趨勢。例如  , 金等人。 (2022) 在電紡微纖維上生物打印復合生物墨水， 以實現(xiàn) 更好的細胞粘附。在生物墨水中添加電紡纖維是為印刷組織提供內(nèi)部  支撐的另一種方法。趙等人。 (2020) 將分散纖維與 CaP 粉末混合用于3D 打印，Chen 等人。 (2020)將纖維與軟骨脫細胞基質(zhì)混合  來制造軟骨組織支架。所有研究均表現(xiàn)出高印刷適性和良好的生物相  容性。然而，纖維在收集器表面隨機靜電紡絲，導致微纖維分布不均  勻。此外，水凝膠中的纖維混合物顯示生物墨水中缺乏微管結(jié)構(gòu)。

在這項研究中，靜電紡絲和生物打印技術(shù)相結(jié)合來制造用于生物打印的管裝水凝膠。本研究的目的是研究靜電紡絲微管對復合支架打印  保真度和生物相容性的影響。假設(shè)是 (1) 在生物打印水凝膠中包含微 管將改善或至少保持可打印性和打印保真度， (2) 嵌入的微管將促進  3D 結(jié)構(gòu)中的細胞粘附和活力。為了檢驗假設(shè)，選擇了水凝膠內(nèi)微管濃 度的三個水平和平均微管長度的三個水平。結(jié)果表明，添加縮短的微  管顯著提高了打印保真度和細胞附著。這項研究有可能為組織工程應(yīng)  用中亞 10 微米尺度的人工毛細血管化支架制造的進步貢獻知識。

2 材料和方法
2.1 靜電紡絲溶液配制
聚乙二醇（PEO，分子量=100,000）粉末和SA粉末購自Sigma- Aldrich。聚苯乙烯（PS，分子量 = 260,000）顆粒來自 AcrosOrganics 。 CMC 粉末獲自MP Biomedicals。二氯甲烷 (DCM) 購  自 Marron Fine Chemicals。去離子水（DI 水）取自 Millipore Milli -Q 系統(tǒng)。食品級染料購自 Chefmaster。

通過將17%wt/vol PS（鞘液）和12%wt/vol PEO（芯液）分別 溶解在DCM中，在室溫下磁力攪拌4小時來制備靜電紡絲溶液。首先 將帶有電紡微管的墊子浸入去離子水中 12 小時以溶解 PEO 核。然  后將干燥的墊切成 5mm×5mm 的塊，并通過超聲波振動（Fisherband Model 50 聲波粉碎機）在 20 kHz 和 100% 聲波強度下破碎 1 和 2 分鐘。通過在掃描電子顯微鏡（SEM） 圖像中隨機選擇20個 微管并手動測量微管壁與端部之間的距離來測量微管直徑和長度�；�  于管濃度（wt/vol%）和微管長度(μm）的五組被設(shè)置為對照（無微 管）、0.05%長（長長度為0.05% PS微管）、0.05%短（短為0.05  % PS微管）長度），長 0.1%，短0.1%。在每次超聲振動中，稱重  12.5mg 微管并分散在 10ml 70% wt/vol 乙醇中。室溫風干后，將 3% wt/vol CMC 和 1% wt/vol SA 與破碎的微管溶解在去離子水中 , 通過磁力攪拌 72 小時制成生物打印溶液。

2.3  生物打印
生物打印過程在BIO X生物打印機（Cellink）上進行，實驗流程如圖1 所示。

FIGURE 1 實驗過程示意圖。 CMC，羧甲基纖維素；PEO、聚乙二醇； PS、聚苯乙烯； SA ，海藻酸鈉。

生物墨水用食品級染料染成不同顏色。復合生物墨水是從連接到噴  嘴直徑為 0.41 毫米的空氣壓縮機的 3 毫升注射器中擠出的。對于  所有五組，擠壓壓力均為 20 kPa，掃描速度設(shè)置為 10 mm/s。每 組選擇三個重復。為了測量不同組的細絲尺寸和合并面積， 以 10%  填充密度和 0.41 mm 層高打印 20 × 20 × 1mm 網(wǎng)格（圖 2a 、b ) 。隨機選擇20根細絲進行尺寸測量，并取10個樣品進行合并面積 測量。
 

FIGURE 2 (a)長絲尺寸測量。 (b)合并面積測量。 (c)微管對準分析。 （d1-d3）微管密度分析：（d1）原始圖像（d2）灰度圖像（d3）閾值二值圖像（比例尺= 1毫米）

為了測量打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的微管密度，在培養(yǎng)皿上為每組打印另一個 20  × 20 × 0.5 mm 的單層，填充密度為 10%，層高為 0.12 mm。每組 采集十個樣品進行密度分析。所有樣品均使用 EVOS XL Core 光學顯 微鏡 (Thermo Fisher Scientific Inc.) 進行觀察，并通過 ImageJ (LOCI) 進行分析。進行方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計分析。分別以微 管濃度和超聲處理時間為變量， 以微管密度為響應(yīng)變量。通過統(tǒng)計分 析軟件（北卡羅來納州立大學）計算p值來證明假設(shè)。將圖像轉(zhuǎn)換為  16 位以進行像素分析（圖 2d）都需要微管密度和對齊分析。一些微 管包括珠子形成。密度分析通過調(diào)整圖像的灰度閾值來識別微管，并 計算暗區(qū)的比例以獲得微管密度。

比對分析是通過OrientaionJ軟件包進行的，該軟件包是ImageJ中的  插件之一。通過評估局部鄰域內(nèi)的梯度結(jié)構(gòu)張量，可以表達圖像的方  向和各向同性性質(zhì)。在本研究中，我們將局部鄰域的標準差設(shè)置為2    個像素，并通過三次樣條方法計算梯度。結(jié)果繪制了從-90°到90°不  同程度的微管取向分布。如圖2c所示，0度代表水平微管，90度代表 垂直微管。 0 度的高取向分布意味著大多數(shù)微管是水平的并且具有與 生物打印方向相同的方向。 Y 軸表示圖像處理中對齊分析檢測到的像 素數(shù)。

2.4 SEM
將五組水凝膠在攪拌熱板（Thermo Fisher Scientific）上于 65°C 加熱一小時。水凝膠充分干燥后，用濺射鍍膜機對樣品進行鍍膜1分鐘。使用場發(fā)射SEM（Zeiss的Supra 55 VP） 以15 kV電子高壓在 ×245放大倍數(shù)下拍攝SEM圖像。

2.5 流變測試
流變學和粘度測量由 TA Instruments Discovery HR 30 流變儀(Waters) 進行。通過在固定 1.0% 應(yīng)變下將角頻率從 0.1 改變到100.0 rad/s 來測量水凝膠的儲能模量和損耗模量。通過改變 1 至  100 1/s 的流量掃描來研究剪切應(yīng)力和粘度。兩個程序的溫度均保持 在 25°C，浸泡時間為 180.0 秒。

2.6 膨脹測試
將五組（10 mm×10 mm×10 mm ）的微管嵌入水凝膠立方體交聯(lián)并 浸入3 mL 20% CaCl2 溶液中。交聯(lián) 24 小時后，將立方體從 3D   打印模具中取出， 以確保立方體完全交聯(lián)。然后將立方體浸入去離子 水中，每 12 小時稱重一次，通過公式（1）計算其膨脹率。初始重  量（W0）為24小時時的重量，36小時、48小時、 96小時時 的重量為濕重（Wt）

2.7 滲透性測試
將五個圓盤（30 mm×30mm×3mm）成型并在20％CaCl2溶液中   交聯(lián)24小時，共五組。然后將圓盤浸入食品級染料中，液位與圓盤高度相匹配。滲透率可以從染色區(qū)域觀察，滲透率可以通過以下公式計 算：

2.8 細胞毒性評價
通過細胞計數(shù)試劑盒 8 測定 (CCK-8) 評估 PS 微管對人臍靜脈內(nèi)皮 細胞系（HUVEC，源自 Angio-Protomie）的細胞毒性。將微管用70% 乙醇滅菌 30 分鐘，然后用杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水 (DPBS)沖洗兩次。將細胞以 1 × 105 個細胞/cm2 接種在 96 孔培養(yǎng)板中  , 并在 37°C 、5% CO2 Thermo Scientific Forma 系列 3）下于  200 μL  內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（內(nèi)皮生長培養(yǎng)基 [EGM]-2） 中孵育水 套 CO2 培養(yǎng)箱）。孵育 24 小時后，用 DPBS 沖洗細胞，并將細胞 暴露于含有 200 μL 培養(yǎng)基的 3 mg PS 微管中。僅含有培養(yǎng)基中的  HUVEC 的孔作為陰性對照，僅含有 EGM-2 的孔作為空白。孵育 48  小時后，除去用過的培養(yǎng)基，并向每孔中添加 10:1 EGM-2/CCK-8   溶液，孵育 4 小時。 4小時后，觀察顏色變化，并將每孔100μL溶液 轉(zhuǎn)移至新的96孔板中。對于每個實驗井，都制作了技術(shù)復制品。使用 酶標儀在 450 nm 波長處測量樣品的吸光度。根據(jù)以下等式，細胞活力以百分比表示：

其中 OD 代表光密度。

2.9 細胞附著
紅色熒光蛋白 (RFP) 標記的 HUVEC 購自 Angio-Protomie。將細胞  以 5000 個細胞/cm2 的密度接種到 T-25 培養(yǎng)瓶中，并在 EGM-2  （SinglQuot Kit） 中生長直至 80% 匯合。為了獲得更好的超聲振動 性能，選擇17％PS微管，在10mL 70％乙醇中超聲振動2min。在生  物安全柜中蒸發(fā)乙醇24小時后，將微管與培養(yǎng)基混合均勻。使用 0.    25% 胰蛋白酶分離 RFP-HUVEC 細胞 1 分鐘，并通過以 220 rpm    離心 5 分鐘收集。細胞懸液的最終密度為9.45×105細胞/mL。首先 將 200 μL 微管懸浮液沉積在 24 孔板上以提供 3D 結(jié)構(gòu)，然后用移 液器將 150 μL 細胞懸浮液接種到微管上。將板放入培養(yǎng)箱中保存 4  小時，使細胞附著在微管上，然后向每孔中添加 200 μL 培養(yǎng)基。每 2 天更換總共 200 μL 培養(yǎng)基， 以最大程度地減少培養(yǎng)基更換過 程中微管的損失。

3 結(jié)論
3.1 微管斷裂
如圖 3 所示，選擇 5 個超聲處理時間（0.5 、1 、1.5 、2 和 2.5 分  鐘）進行微管切割。隨著時間的推移，27% PS 微管和 17% PS 微管 的管長度均呈現(xiàn)下降趨勢。盡管 27% PS 微管的平均直徑 (3.50 µm )  比 17% PS 微管 (2.08 µm) 更大，但較高的濃度使得泵送溶液進  行靜電紡絲變得困難。在這種情況下，采用超聲處理時間為 1 和 2分鐘的 17% PS 微管進行進一步研究。超聲振動1分鐘和2分鐘的平 均管長分別為397.16和145.42μm。

3.2 打印保真度和微管密度

FIGURE 3(a) Boxplot of 17% PS microtube length in different sonication time. (b) Boxplot of 27% PS microtube length in different sonication time (PS, polystyrene).

為了觀察細絲和合并區(qū)域，將五組打印成20×20mm的網(wǎng)格（圖4a） 。根據(jù)管濃度（wt/vol%）和微管長度(μm）設(shè)置五組作為對照（無 微管）、0.05%長（長長度為0.05% PS微管）、0.05%短（短長度  為0.05% PS微管） ，0.1% 多頭，0.1% 空頭。所有五組均成功打印 出網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。方差分析測試還證明，微管的存在對細絲尺寸有顯著影  響（p <0.0001）。微管濃度和長度均顯著影響細絲尺寸，分別為 p  <0.0001 和 p =0.0215。網(wǎng)格合并區(qū)域的分析（圖 5b）表明，具有較長微管或較高微管濃 度的組均對打印保真度具有顯著影響，分別為 p <0.0001 和 p =0.    0003。通過比較對照組和其他組的合并區(qū)域，我們可以看到微管通  過使印刷/設(shè)計比率接近 100% 來提高印刷保真度。
 

FIGURE 6    Storage modulus and loss modulus of different hydrogels.

長和 0.1% 短的組，當角頻率約為 60-70 rad/s 時，Gʹ 與 Gʹʹ 交叉  , 這表明這些水凝膠在高角頻率下更像固體。對于對照組和 0.05%    的短路，Gʹʹ  比 Gʹ 大 100 rad/s，并且更像液體的狀態(tài)導致打印網(wǎng)格 的保真度降低。

剪切應(yīng)力-剪切速率曲線（圖7a）顯示剪切稀化特性，這表明隨著 剪切速率的增加，非牛頓流體的粘度降低（圖7b）。與其他三組相比, 0.05%長和0.1%短的組具有最高的剪切應(yīng)力和粘度，表明在生物打 印過程中具有更好的打印性能。這表明復合水凝膠具有良好的流變性  能，適合生物打印。

3.4 溶脹及滲透性測試
斷裂。表明在合理的時間范圍內(nèi)具有良好的生物降解性。 0.1%短組 的腫脹率最大，對照組大部分時間腫脹率最小。表明具有微管的基團 可以提供水滲透的通道。

滲透率分析在 7 天的時間內(nèi)進行。如圖 9b 所示，7 天后所有五 組均顯示滲透面積增加。對照組的通透性高于其他組。對于4個微管  組，0.05%長組的滲透性高于其他組，0.1%長組的滲透性最小。

隨著時間的增加，樣品的腫脹率呈增加趨勢，如圖8所示。所有五組  均在前48小時內(nèi)出現(xiàn)最急劇的增加。 96小時時，在樣品表面觀察到斷裂。表明在合理的時間范圍內(nèi)具有良好的生物降解性。 0.1%短組 的腫脹率最大，對照組大部分時間腫脹率最小。表明具有微管的基團 可以提供水滲透的通道。

滲透率分析在 7 天的時間內(nèi)進行。如圖 9b 所示，7 天后所有五 組均顯示滲透面積增加。對照組的通透性高于其他組。對于4個微管  組，0.05%長組的滲透性高于其他組，0.1%長組的滲透性最小。
 

FIGURE 7 (a) Shear stress-shear rate curve,
(b) viscosity-shear rate curve.

FIGURE 8  (a) Swelling rate test of Day 0 (scale bar = 2 cm). 
(b) Swelling rate of hydrogel.
 

FIGURE 9 (a) Permeability test of Day 0 and 7 (scale bar = 5cm). 
(b) Permeability of hydrogels.

FIGURE10 (a) RFP images for cell attachment from Day 0 to 11.
(b) Overlay images for cell attachment from Day 4 to 11 (scale bar = 300 µm).
(c) Biocompatibility results of PS microtubes. PS, polystyrene; RFP, red fluorescent protein.

3.5 生物相容性和細胞附著測試
PS微管的生物相容性測定結(jié)果如圖10c所示。盡管與僅使用 HUVEC   相比，細胞活力下降至 87.31%，但活力的雙樣本 t 檢驗的 p 值為  0.2184，大于 0.05。這表明 PS 微管不會顯著影響細胞活力，并且 與測試的細胞具有生物相容性。

生物相容性測試后進行細胞貼壁。通過將微管分散并混合在介質(zhì) 中，使微管懸浮在介質(zhì)中并形成三維結(jié)構(gòu)。細胞附著的光學顯微鏡圖 像如圖10所示。孵育4小時后，細胞開始附著到微管上。這種初步的 細胞培養(yǎng)表明，微管為 HUVEC 細胞提供了附著，它們可用于潛在的 毛細管支架。

4 討論
在本文中，我們將靜電紡絲微管與 CMC/SA 水凝膠結(jié)合起來，用于  生物打印支架的血管化。這項研究不同于傳統(tǒng)的混合生物打印，即在 生物打印結(jié)構(gòu)的每一層中插入靜電紡絲墊（Naghieh 等人，2017 年 ; Vyas 等人，2020 年）。微管通過超聲波振動破碎并均勻分散在  復合生物墨水中。該方法顯示了制造過程的簡單性、支架孔隙率的均 勻性以及支架的多向血管化潛力。

水凝膠本質(zhì)上是粘彈性的，可以通過改變聚合物或交聯(lián)劑濃度來 調(diào)節(jié)材料的粘彈性（Mattei et al., 2017）。當一個聚合物鏈與另一 個聚合物鏈連接并形成更大的鏈或網(wǎng)時，就會發(fā)生交聯(lián)過程（Lopez   Hernandez 等人，2021 ）。較長的聚合物鏈纏結(jié)并增加溶液粘度。

在未交聯(lián)的水凝膠中添加微管將增加水凝膠的整體密度和粘度。從噴  嘴擠出時，一些微管會相互纏結(jié)，因此有助于保持水凝膠的形狀保真  度。生物打印過程結(jié)束后，微管-水凝膠界面的剪切應(yīng)力會將水凝膠保 持在一起，這減少了未交聯(lián)水凝膠的液體流動效應(yīng)， 同時仍然適合擠  出�？紤]到微管與水凝膠相比是固體，水凝膠中較高的微管密度將導  致在相同的時間和打印壓力下擠出更少的水凝膠，與3D模型相比減少 了過量的水凝膠擠出。

作為非牛頓液體，復合CMC/SA水凝膠從噴嘴擠出后會延伸，導  致細絲尺寸大于噴嘴尺寸。隨著微管混合在復合水凝膠中，復合生物  墨水的整體粘度增加，轉(zhuǎn)變?yōu)楦�固體的狀態(tài)。圖 5 顯示，微管濃度和 長度對打印結(jié)構(gòu)中的細絲尺寸、合并面積和微管密度有顯著影響。更  高的濃度和更短的微管可以更好地與復合水凝膠結(jié)合，最大限度地提  高其對生物墨水流變特性的影響。與 0.05% 短的組相比，0.05% 長 的組顯示出接近 100% 的比率，表明微管濃度和長度之間存在交互作 用。

然而，濃度較低和微管較短（短0.05%）的組在五組中表現(xiàn)出最低的 網(wǎng)格面積比。這表明微管長度和濃度對細絲合并具有交互影響。一種 可能的解釋可能是由于復合生物墨水的擠出量較高，導致合并面積增 加。圖 5c 顯示，較高的濃度和較短的微管會導致打印結(jié)構(gòu)中微管密 度的增加，其中 0.05% 短組顯示密度最低。人們認為，微管濃度比 微管長度起著更重要的作用，并且較短的微管濃度越高，印刷結(jié)構(gòu)中 的微管密度就越高。

流變特性解釋了水凝膠生物打印過程的本質(zhì)。較高的儲能模量 (Gʹ ) 表明水凝膠需要更大的能量來扭曲樣品結(jié)構(gòu)，較高的損耗模量 (Gʹʹ)   表明水凝膠具有存儲更多能量的能力 (Zin et al., 2019)。在圖 6 中  , 對照組和 0.05% 短組的 Gʹʹ 高于 Gʹ , 表明其行為更像液體。 0.05 %長和0.1%短的組具有更高的Gʹ 、Gʹʹ、剪切應(yīng)力和粘度，表明比其他  組更好的印刷保真度。 0.05% 長、0.1% 長和 0.1% 短組在較高角頻 率（大約 60-70 rad/s）下轉(zhuǎn)變?yōu)楦�接近固體的狀態(tài)。我們還可以看 到，隨著微管濃度和長度的增加，隨著角頻率的增加，水凝膠的液體  到固體的轉(zhuǎn)變發(fā)生得更早。圖 5a 證實了與對照組相比，這兩組的燈  絲尺寸和網(wǎng)格面積有所改善。然而，剪切稀化特性表明，3% CMC/1  % SA 的復合水凝膠可能不是理想的生物打印材料，盡管具有增加水  凝膠粘度的好處。

微管的添加對復合生物墨水的膨脹和滲透性能有顯著影響。在圖  8中，在96小時內(nèi)，與對照組相比，所有微管組都表現(xiàn)出更高的膨脹  率，其中0.1%短組顯示出明顯更高的膨脹率，這可能是由于較短的微 管提供的微通道增加，促進了流體流動和膨脹的增強。在圖 9 中，所 有組都表現(xiàn)出良好的滲透性，使它們成為未來細胞培養(yǎng)應(yīng)用的有希望  的候選者。然而，與對照組相比，所有微管組均表現(xiàn)出較低的滲透性  , 并且更長和更高濃度的微管對降低滲透性的影響更顯著。在這兩個  參數(shù)中，微管濃度似乎對滲透性的降低起著更重要的作用。這表明固  態(tài)微管可能會通過阻塞高微管密度和長度的滲透通道而對支架產(chǎn)生不  利影響。因此，在未來的細胞培養(yǎng)中，最小化微管長度并優(yōu)化水凝膠  支架中的微管密度非常重要。

體外實驗表明電紡PS微管與HUVEC細胞具有生物相容性。培養(yǎng)基 中分散的微管被懸浮，并在 3D 空間中提供了更大的空間和高體積重 量比， 以實現(xiàn)更好的細胞附著和增殖。如圖 10a 所示，4 小時后，HUVEC 細胞從圓形變?yōu)闂l形，并在 3D 空間中跨越不同的微管。幾 天后，一些細胞成功地擴展到多個微管， 同時與其他細胞建立了通訊 。結(jié)果表明PS微管具有促進細胞增殖和分化的潛力。

5 結(jié)論
簡而言之，本研究研究了同軸靜電紡絲微管在毛細血管化復合生物打  印過程中的潛力。通過打印水凝膠中均勻分散的微管以及可調(diào)節(jié)的微  管長度和濃度，我們的團隊能夠制造具有微尺度通道和可控宏觀幾何  形狀的混合仿生血管化支架。我們的結(jié)果表明，靜電紡絲微管的添加  對打印絲尺寸和打印保真度有顯著影響。此外，水凝膠中的微管濃度  影響印刷水凝膠內(nèi)的微管密度。在五個組中，0.1%長的組具有較高的 微管濃度和較長的長度，顯示出最好的生物打印結(jié)果。此外，0.1%短 組的膨脹率最高，對照組的滲透性最好。 PS 微管與 HUVEC 細胞兼  容，具有毛細血管化的潛力。未來的工作將集中于交聯(lián)水凝膠細胞培  養(yǎng)和生物打印過程中微管運動的模擬。還將研究與 5-10μm 的天然人 體毛細血管尺寸一致的更大微管的制造。