恢復(fù)核心生物鐘分子 BMAL1 的抑制表達(dá)可防止壓縮誘導(dǎo)的椎間盤退變
生物鐘是一種高度保守的內(nèi)源性自主計(jì)時(shí)系統(tǒng)，可在恒定的 24 小時(shí)循環(huán)節(jié)律中維持身體生理和行為。在分子水平上，生物鐘由復(fù)雜的自我調(diào)控的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路（TTFLs）構(gòu)成，調(diào)控下游基因的節(jié)律性表達(dá)。Bmal1 是 TTFLs 中必不可少的核心生物鐘分子，敲除該基因會(huì)造成外周組織生物鐘節(jié)律的紊亂并消除 CLOCK-BMAL1 異二聚體的轉(zhuǎn)錄功能。據(jù)報(bào)道，生物鐘紊亂與許多疾病密切相關(guān)，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、肝腎功能障礙和骨關(guān)節(jié)炎等。然而，生物鐘在椎間盤退變（IDD）發(fā)展中的作用尚不清楚。
下腰痛（LBP）和 IDD 是所有年齡段人群極為常見的癥狀。機(jī)械負(fù)荷在脊柱發(fā)育和維持脊柱穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。目前的證據(jù)表明，累積的機(jī)械應(yīng)力，尤其是過度的壓縮應(yīng)力，會(huì)損害細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝并誘導(dǎo)髓核（NP）細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致 ECM 降解并最終導(dǎo)致 IDD。椎間盤（IVD）是一種高度節(jié)律性的組織，經(jīng)歷著每日的活動(dòng)/休息所施加的周期性負(fù)荷。輪班工作會(huì)擾亂人體的晝夜節(jié)律，被認(rèn)為是腰痛的危險(xiǎn)因素。有研究表明，IVD 是一個(gè)存在外周生物鐘節(jié)律的組織，該生物鐘可以通過衰老來調(diào)節(jié)，并被 IL-1β 破壞。然而，異常機(jī)械負(fù)荷對(duì) IVD 生物鐘的影響及其在 IDD 發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚未得到探索。
基于此，在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科、放射科和第四軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)系以及英國曼徹斯特大學(xué)生物醫(yī)學(xué)健康學(xué)院的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，系統(tǒng)地分析了人 NP 組織樣本中 BMAL1 表達(dá)與 IDD 嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，并進(jìn)一步證明了外周時(shí)鐘的抑制參與過度機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的 IDD 進(jìn)展。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)過度負(fù)荷激活了 RhoA/ROCK 通路，從而導(dǎo)致 NP 細(xì)胞中 BMAL1 表達(dá)降低，Y-27632 和褪黑激素對(duì) RhoA/ROCK 通路的抑制部分恢復(fù)了 BMAL1 的表達(dá)并成功改善了 IDD 的進(jìn)展。研究成果發(fā)表在 Bone Research 期刊題為“Restoring the dampened expression of the core clock molecule BMAL1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration”。
首先，研究人員收集了 149 份不同 Pfirrmann 分級(jí)（Ⅱ、Ⅲ級(jí)樣本為中度退變組，Ⅳ、Ⅴ級(jí)樣本為重度退變組）的 NP 樣本來檢測(cè) BMAL1 的表達(dá)。8例均有中度 IDD 和重度 IDD 節(jié)段的患者 NP 組織免疫熒光染色和 MRI 顯示，BMAL1 在重度退變節(jié)段的表達(dá)顯著低于中度組。對(duì)所有149 個(gè) NP 樣本中 BMAL1 陽性細(xì)胞百分比與 Pfirrmann 分級(jí)之間的關(guān)系進(jìn)行單因素線性回歸，發(fā)現(xiàn) BMAL1 表達(dá)與 IDD Pfirrmann 分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。
然后進(jìn)行了多元線性回歸分析，檢驗(yàn)?zāi)挲g和性別對(duì) BMAL1 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)年齡和 Pfirrmann 分級(jí)是影響 BMAL1 表達(dá)的兩個(gè)主要負(fù)相關(guān)因素，性別是無關(guān)因素。此外，Logistics 回歸的結(jié)果發(fā)現(xiàn)椎間盤退變程度的增加僅與 BMAL1 表達(dá)水平的降低有關(guān)，與年齡無關(guān)，這一結(jié)論似乎與年齡引起 BMAL1 降低的結(jié)果相矛盾。因此，通過單獨(dú)線性回歸分析探索具有相似 Pfirrmann 分級(jí)的 NP 組織 BMAL1 表達(dá)與年齡之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)僅在中度 IDD 組中，年齡與 BMAL1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示在IDD的早期階段，年齡是影響 BMAL1 表達(dá)的因素，而其他因素（如異常負(fù)荷）可能在 IDD 后期進(jìn)展中起更重要的作用。
為了確認(rèn)人 NP 組織具有正常的生物鐘功能，用慢病毒 Per-Luc 轉(zhuǎn)染人類原代 NP 細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)其生物發(fā)光（圖1 a）。為了測(cè)試過度的機(jī)械負(fù)荷是否會(huì)抑制 IVD 晝夜節(jié)律，將小鼠中分離的 IVD 外植體進(jìn)行循環(huán)壓縮（1.0 MPa、1 Hz和2 h）。與未壓縮相比，壓縮的外植體晝夜節(jié)律幅度明顯降低，相位延遲顯著，但周期無變化（圖1 b）。此外，機(jī)械負(fù)荷幅度的進(jìn)一步增加（2.0 MPa、1 Hz 和1 h）導(dǎo)致小鼠 IVD 外植體的晝夜節(jié)律完全喪失（圖1 c）。這說明，過度的機(jī)械負(fù)荷會(huì)擾亂 IVD 生物鐘。
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員假設(shè)恢復(fù) BMAL1 表達(dá)的抑制可能部分改善過度壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞功能障礙。為了測(cè)試過度壓縮對(duì) BMAL1 表達(dá)和 ECM 穩(wěn)態(tài)的不利影響，將 NP 細(xì)胞在 0、12、24、36 和 48 h 內(nèi)進(jìn)行 1.0 MPa 的靜態(tài)壓縮。免疫熒光染色顯示 BMAL1 表達(dá)隨時(shí)間逐漸降低，IVD 穩(wěn)態(tài)也受到干擾。這表明，過度壓縮會(huì)損害 BMAL1 的表達(dá)并導(dǎo)致 NP 細(xì)胞功能障礙。
然后過表達(dá) BMAL1 以研究 Bmal1 表達(dá)的增加是否可以挽救壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞功能障礙。結(jié)果顯示，BMAL1 過表達(dá)減輕了壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞凋亡。Western blot測(cè)定也證實(shí)，BMAL1 過表達(dá)恢復(fù)了 NP 細(xì)胞在壓縮應(yīng)激下的代謝穩(wěn)態(tài)以及 Aggrecan 的表達(dá)，這表明，BMAL1 表達(dá)的缺失和生物鐘的破壞是壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞功能障礙的重要因素。上調(diào) BMAL1 表達(dá)是預(yù)防壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞凋亡和功能障礙的有效方法。
接下來，為了研究了 BMAL1 KO 對(duì) NP 組織的影響，構(gòu)建 Col2a1-Bmal1 KO 條件性敲除小鼠（cKO）。結(jié)果顯示，cKO 小鼠椎間盤高度指數(shù)顯著降低（圖2 a、c），IVD 中信號(hào)強(qiáng)度較低（圖2 b、c），表明 NP 組織的退變表型。與 WT 小鼠相比，cKO 小鼠 NP 和內(nèi)部 AF 組織中 Proteoglycan 丟失增強(qiáng)（圖2 d）。cKO 小鼠 IVDs 中 Proteoglycan 填充較少的區(qū)域與 BMAL1 缺失細(xì)胞填充的區(qū)域一致（圖2 e）。此外，cKO 小鼠中 Aggrecan 降低，MMP13 表達(dá)增加，表明 Bmal1 缺失可能導(dǎo)致 ECM 降解，從而導(dǎo)致 IDD 的發(fā)展（圖2 e）。因此，BMAL1 對(duì) NP 穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其缺失可誘導(dǎo) IDD 的發(fā)展。
RhoA/ROCK 通路在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。因此，研究假設(shè) RhoA/ROCK 信號(hào)可能參與介導(dǎo)壓縮應(yīng)力對(duì) IVD 生物鐘的影響。通過使用 Y-27632 在壓縮應(yīng)力下抑制 RhoA/ROCK 通路，結(jié)果顯示，BMAL1 在壓縮力下顯著降低，Y-27632 處理后以劑量依賴性方式逐漸恢復(fù)（圖3 a、b）。
進(jìn)一步地，為了測(cè)試 Y-27632 是否通過上調(diào) BMAL1 來挽救 NP 細(xì)胞凋亡和 ECM 降解，用 BMAL1-siRNA 轉(zhuǎn)染 NP 細(xì)胞。與僅受壓縮應(yīng)力的 NP 細(xì)胞相比，Y-27632 處理后 TUNEL 陽性率降低。此外，Y-27632 部分恢復(fù)了 NP 細(xì)胞中壓縮誘導(dǎo)的 BMAL1 和 Aggrecan 的減少和 MMP13 的增加。單獨(dú)使用 si-Bmal1 可顯著降低 Aggrecan 的表達(dá)，增加 MMP13 的表達(dá)。更重要的是，BMAL1-siRNA 轉(zhuǎn)染完全消除了 Y-27632 的治療效果。補(bǔ)充 Y-27632 不會(huì)減弱 BMAL1 敲低誘導(dǎo)的代謝紊亂（圖3 c-f）。這些結(jié)果表明，壓縮應(yīng)力通過激活 RhoA/ROCK 通路降低 BMAL1 的表達(dá)，Y-27632 抑制 RhoA/ROCK 通路部分減弱了 BMAL1 表達(dá)的降低，從而改善了壓縮應(yīng)力誘導(dǎo)的 IDD 過程。
褪黑素是最常用的調(diào)控中樞節(jié)律異常的藥物。為了測(cè)試褪黑素是否通過抑制 RhoA/ROCK 通路恢復(fù) BMAL1 表達(dá)并減輕 IDD 的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)使用 RhoA/ROCK 信號(hào)通路的激動(dòng)劑花生四烯酸（AA）。與加壓組相比，加入褪黑素后 TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量減少，AA 處理完全消除了這種影響（圖3 g）。此外，加壓組的 p-MLC 表達(dá)（RhoA / ROCK通路激活標(biāo)志物）顯著增加，而褪黑素降低了 p-MLC 的表達(dá)，但這種作用被 AA 阻斷（圖3 h、i）。24 h、1.0 MPa 的壓縮導(dǎo)致 BMAL1 和 Aggrecan 表達(dá)降低，MMP13 表達(dá)增加，褪黑素處理阻止了 BMAL1 的降低以及 Aggrecan 和 MMP13 表達(dá)的變化，添加 AA 后，這種保護(hù)作用消失（圖3 h、j）。這些結(jié)果表明，褪黑素可以通過抑制 RhoA/ROCK 通路來阻止 BMAL1 表達(dá)的下調(diào)。
研究人員通過器官型組織外植體培養(yǎng)來驗(yàn)證這一機(jī)制。Y-27632 和褪黑素顯著緩解了壓力引起的髓核細(xì)胞凋亡增加和 BMAL1 及 Aggrecan 表達(dá)降低。加壓 12 天后，椎間盤髓核組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生了相對(duì)明顯的變化，細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，褪黑素和 Y-27632均緩解了這一改變。這些結(jié)果證實(shí)，阻斷 RhoA/ROCK 通路可改善 NP 組織中壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞凋亡和 ECM 降解。
最后，為了研究 Y-27632 和褪黑素對(duì)體內(nèi) IDD 的影響，實(shí)驗(yàn)建立了一種新的壓縮誘導(dǎo)大鼠模型，然后在椎間盤內(nèi)給藥 20 μmol·L−1 Y-27632 或 500 μmol·L−1褪黑素。結(jié)果顯示，28天后，壓縮+ PBS組的椎間隙高度指數(shù)（DHI）顯著降低，壓縮+ Y-27632 組和壓縮+ 褪黑素組 DHIs 均有所增加。MRI 還顯示，壓縮+ PBS 組的 Pfirrmann 分級(jí)評(píng)分明顯更高，然而，Y-27632 或褪黑素治療28 天后顯著降低了這些評(píng)分（圖4 a、b）。
此外，壓縮+ PBS 組的 NP 細(xì)胞數(shù)量減少，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)排列紊亂，ECM 降解增加，而 Y-27632 和褪黑素治療均改善了組織學(xué) IDD 變化。TUNEL 染色顯示，壓縮+ PBS 組 NP 組織的細(xì)胞凋亡顯著增加，使用褪黑素和 Y-27632 治療后，這一退變狀況得到了顯著改善（圖4 c、d）。免疫熒光染色顯示，壓縮28 天后，NP 組織中 BMAL1 和Aggrecan 表達(dá)顯著降低，MMP13 表達(dá)增加，而 Y-27632 和褪黑素治療均部分減輕了 NP 組織中 ECM 失衡并恢復(fù)了 BMAL1 的表達(dá)（圖4 e）。這些結(jié)果表明 Y-27632 和褪黑素在壓縮誘導(dǎo)的大鼠模型中恢復(fù)了 BMAL1 的表達(dá)并改善了 IDD 進(jìn)展，進(jìn)一步驗(yàn)證了 Y-27632 和褪黑素在體內(nèi)的治療效果。
圖5 圖形概要。（a）臨床樣本采集及BMAL1水平分析。（b）通過抑制RhoA/ROCK通路，過度負(fù)荷抑制IVDs的生物鐘，上調(diào)BMAL1表達(dá)以減輕壓縮誘導(dǎo)的IDD的分子機(jī)制。（c）褪黑素和 Y-27632 在晝夜壓縮模型中部分恢復(fù)了 BMAL1 表達(dá)并緩解了 IDD。
總之，該研究表明，過度負(fù)荷會(huì)抑制 IVD 生物鐘。此外，通過抑制 RhoA/ROCK 通路上調(diào) BMAL1 表達(dá)可減輕壓縮誘導(dǎo)的 IDD。這些結(jié)果為 IDD 的發(fā)展提供了新的見解，并為IDD的預(yù)防提供了新的治療策略。
參考文獻(xiàn)：Wang D, Peng P, Dudek M, Hu X, Xu X, Shang Q, Wang D, Jia H, Wang H, Gao B, Zheng C, Mao J, Gao C, He X, Cheng P, Wang H, Zheng J, Hoyland JA, Meng QJ, Luo Z, Yang L. Restoring the dampened expression of the core clock molecule BMAL1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration. Bone Res. 2022 Feb 25;10(1):20. doi: 10.1038/s41413-022-00187-z. PMID: 35217644; PMCID: PMC8881495.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35217644/
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基于此，在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科、放射科和第四軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)系以及英國曼徹斯特大學(xué)生物醫(yī)學(xué)健康學(xué)院的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，系統(tǒng)地分析了人 NP 組織樣本中 BMAL1 表達(dá)與 IDD 嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，并進(jìn)一步證明了外周時(shí)鐘的抑制參與過度機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的 IDD 進(jìn)展。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)過度負(fù)荷激活了 RhoA/ROCK 通路，從而導(dǎo)致 NP 細(xì)胞中 BMAL1 表達(dá)降低，Y-27632 和褪黑激素對(duì) RhoA/ROCK 通路的抑制部分恢復(fù)了 BMAL1 的表達(dá)并成功改善了 IDD 的進(jìn)展。研究成果發(fā)表在 Bone Research 期刊題為“Restoring the dampened expression of the core clock molecule BMAL1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration”。
首先，研究人員收集了 149 份不同 Pfirrmann 分級(jí)（Ⅱ、Ⅲ級(jí)樣本為中度退變組，Ⅳ、Ⅴ級(jí)樣本為重度退變組）的 NP 樣本來檢測(cè) BMAL1 的表達(dá)。8例均有中度 IDD 和重度 IDD 節(jié)段的患者 NP 組織免疫熒光染色和 MRI 顯示，BMAL1 在重度退變節(jié)段的表達(dá)顯著低于中度組。對(duì)所有149 個(gè) NP 樣本中 BMAL1 陽性細(xì)胞百分比與 Pfirrmann 分級(jí)之間的關(guān)系進(jìn)行單因素線性回歸，發(fā)現(xiàn) BMAL1 表達(dá)與 IDD Pfirrmann 分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。
然后進(jìn)行了多元線性回歸分析，檢驗(yàn)?zāi)挲g和性別對(duì) BMAL1 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)年齡和 Pfirrmann 分級(jí)是影響 BMAL1 表達(dá)的兩個(gè)主要負(fù)相關(guān)因素，性別是無關(guān)因素。此外，Logistics 回歸的結(jié)果發(fā)現(xiàn)椎間盤退變程度的增加僅與 BMAL1 表達(dá)水平的降低有關(guān)，與年齡無關(guān)，這一結(jié)論似乎與年齡引起 BMAL1 降低的結(jié)果相矛盾。因此，通過單獨(dú)線性回歸分析探索具有相似 Pfirrmann 分級(jí)的 NP 組織 BMAL1 表達(dá)與年齡之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)僅在中度 IDD 組中，年齡與 BMAL1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示在IDD的早期階段，年齡是影響 BMAL1 表達(dá)的因素，而其他因素（如異常負(fù)荷）可能在 IDD 后期進(jìn)展中起更重要的作用。
為了確認(rèn)人 NP 組織具有正常的生物鐘功能，用慢病毒 Per-Luc 轉(zhuǎn)染人類原代 NP 細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)其生物發(fā)光（圖1 a）。為了測(cè)試過度的機(jī)械負(fù)荷是否會(huì)抑制 IVD 晝夜節(jié)律，將小鼠中分離的 IVD 外植體進(jìn)行循環(huán)壓縮（1.0 MPa、1 Hz和2 h）。與未壓縮相比，壓縮的外植體晝夜節(jié)律幅度明顯降低，相位延遲顯著，但周期無變化（圖1 b）。此外，機(jī)械負(fù)荷幅度的進(jìn)一步增加（2.0 MPa、1 Hz 和1 h）導(dǎo)致小鼠 IVD 外植體的晝夜節(jié)律完全喪失（圖1 c）。這說明，過度的機(jī)械負(fù)荷會(huì)擾亂 IVD 生物鐘。
圖1 過度的機(jī)械負(fù)荷擾亂了IVDs的生物鐘。
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員假設(shè)恢復(fù) BMAL1 表達(dá)的抑制可能部分改善過度壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞功能障礙。為了測(cè)試過度壓縮對(duì) BMAL1 表達(dá)和 ECM 穩(wěn)態(tài)的不利影響，將 NP 細(xì)胞在 0、12、24、36 和 48 h 內(nèi)進(jìn)行 1.0 MPa 的靜態(tài)壓縮。免疫熒光染色顯示 BMAL1 表達(dá)隨時(shí)間逐漸降低，IVD 穩(wěn)態(tài)也受到干擾。這表明，過度壓縮會(huì)損害 BMAL1 的表達(dá)并導(dǎo)致 NP 細(xì)胞功能障礙。
然后過表達(dá) BMAL1 以研究 Bmal1 表達(dá)的增加是否可以挽救壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞功能障礙。結(jié)果顯示，BMAL1 過表達(dá)減輕了壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞凋亡。Western blot測(cè)定也證實(shí)，BMAL1 過表達(dá)恢復(fù)了 NP 細(xì)胞在壓縮應(yīng)激下的代謝穩(wěn)態(tài)以及 Aggrecan 的表達(dá)，這表明，BMAL1 表達(dá)的缺失和生物鐘的破壞是壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞功能障礙的重要因素。上調(diào) BMAL1 表達(dá)是預(yù)防壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞凋亡和功能障礙的有效方法。
接下來，為了研究了 BMAL1 KO 對(duì) NP 組織的影響，構(gòu)建 Col2a1-Bmal1 KO 條件性敲除小鼠（cKO）。結(jié)果顯示，cKO 小鼠椎間盤高度指數(shù)顯著降低（圖2 a、c），IVD 中信號(hào)強(qiáng)度較低（圖2 b、c），表明 NP 組織的退變表型。與 WT 小鼠相比，cKO 小鼠 NP 和內(nèi)部 AF 組織中 Proteoglycan 丟失增強(qiáng)（圖2 d）。cKO 小鼠 IVDs 中 Proteoglycan 填充較少的區(qū)域與 BMAL1 缺失細(xì)胞填充的區(qū)域一致（圖2 e）。此外，cKO 小鼠中 Aggrecan 降低，MMP13 表達(dá)增加，表明 Bmal1 缺失可能導(dǎo)致 ECM 降解，從而導(dǎo)致 IDD 的發(fā)展（圖2 e）。因此，BMAL1 對(duì) NP 穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其缺失可誘導(dǎo) IDD 的發(fā)展。
圖2 Bmal1的缺失導(dǎo)致NP組織中ECM的降解。
RhoA/ROCK 通路在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。因此，研究假設(shè) RhoA/ROCK 信號(hào)可能參與介導(dǎo)壓縮應(yīng)力對(duì) IVD 生物鐘的影響。通過使用 Y-27632 在壓縮應(yīng)力下抑制 RhoA/ROCK 通路，結(jié)果顯示，BMAL1 在壓縮力下顯著降低，Y-27632 處理后以劑量依賴性方式逐漸恢復(fù)（圖3 a、b）。
進(jìn)一步地，為了測(cè)試 Y-27632 是否通過上調(diào) BMAL1 來挽救 NP 細(xì)胞凋亡和 ECM 降解，用 BMAL1-siRNA 轉(zhuǎn)染 NP 細(xì)胞。與僅受壓縮應(yīng)力的 NP 細(xì)胞相比，Y-27632 處理后 TUNEL 陽性率降低。此外，Y-27632 部分恢復(fù)了 NP 細(xì)胞中壓縮誘導(dǎo)的 BMAL1 和 Aggrecan 的減少和 MMP13 的增加。單獨(dú)使用 si-Bmal1 可顯著降低 Aggrecan 的表達(dá)，增加 MMP13 的表達(dá)。更重要的是，BMAL1-siRNA 轉(zhuǎn)染完全消除了 Y-27632 的治療效果。補(bǔ)充 Y-27632 不會(huì)減弱 BMAL1 敲低誘導(dǎo)的代謝紊亂（圖3 c-f）。這些結(jié)果表明，壓縮應(yīng)力通過激活 RhoA/ROCK 通路降低 BMAL1 的表達(dá)，Y-27632 抑制 RhoA/ROCK 通路部分減弱了 BMAL1 表達(dá)的降低，從而改善了壓縮應(yīng)力誘導(dǎo)的 IDD 過程。
褪黑素是最常用的調(diào)控中樞節(jié)律異常的藥物。為了測(cè)試褪黑素是否通過抑制 RhoA/ROCK 通路恢復(fù) BMAL1 表達(dá)并減輕 IDD 的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)使用 RhoA/ROCK 信號(hào)通路的激動(dòng)劑花生四烯酸（AA）。與加壓組相比，加入褪黑素后 TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量減少，AA 處理完全消除了這種影響（圖3 g）。此外，加壓組的 p-MLC 表達(dá)（RhoA / ROCK通路激活標(biāo)志物）顯著增加，而褪黑素降低了 p-MLC 的表達(dá)，但這種作用被 AA 阻斷（圖3 h、i）。24 h、1.0 MPa 的壓縮導(dǎo)致 BMAL1 和 Aggrecan 表達(dá)降低，MMP13 表達(dá)增加，褪黑素處理阻止了 BMAL1 的降低以及 Aggrecan 和 MMP13 表達(dá)的變化，添加 AA 后，這種保護(hù)作用消失（圖3 h、j）。這些結(jié)果表明，褪黑素可以通過抑制 RhoA/ROCK 通路來阻止 BMAL1 表達(dá)的下調(diào)。
研究人員通過器官型組織外植體培養(yǎng)來驗(yàn)證這一機(jī)制。Y-27632 和褪黑素顯著緩解了壓力引起的髓核細(xì)胞凋亡增加和 BMAL1 及 Aggrecan 表達(dá)降低。加壓 12 天后，椎間盤髓核組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生了相對(duì)明顯的變化，細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，褪黑素和 Y-27632均緩解了這一改變。這些結(jié)果證實(shí)，阻斷 RhoA/ROCK 通路可改善 NP 組織中壓縮誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞凋亡和 ECM 降解。
圖3 通過抑制RhoA/ROCK通路上調(diào)BMAL1表達(dá)可改善壓縮誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡和NP組織中ECM的降解。
最后，為了研究 Y-27632 和褪黑素對(duì)體內(nèi) IDD 的影響，實(shí)驗(yàn)建立了一種新的壓縮誘導(dǎo)大鼠模型，然后在椎間盤內(nèi)給藥 20 μmol·L−1 Y-27632 或 500 μmol·L−1褪黑素。結(jié)果顯示，28天后，壓縮+ PBS組的椎間隙高度指數(shù)（DHI）顯著降低，壓縮+ Y-27632 組和壓縮+ 褪黑素組 DHIs 均有所增加。MRI 還顯示，壓縮+ PBS 組的 Pfirrmann 分級(jí)評(píng)分明顯更高，然而，Y-27632 或褪黑素治療28 天后顯著降低了這些評(píng)分（圖4 a、b）。
此外，壓縮+ PBS 組的 NP 細(xì)胞數(shù)量減少，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)排列紊亂，ECM 降解增加，而 Y-27632 和褪黑素治療均改善了組織學(xué) IDD 變化。TUNEL 染色顯示，壓縮+ PBS 組 NP 組織的細(xì)胞凋亡顯著增加，使用褪黑素和 Y-27632 治療后，這一退變狀況得到了顯著改善（圖4 c、d）。免疫熒光染色顯示，壓縮28 天后，NP 組織中 BMAL1 和Aggrecan 表達(dá)顯著降低，MMP13 表達(dá)增加，而 Y-27632 和褪黑素治療均部分減輕了 NP 組織中 ECM 失衡并恢復(fù)了 BMAL1 的表達(dá)（圖4 e）。這些結(jié)果表明 Y-27632 和褪黑素在壓縮誘導(dǎo)的大鼠模型中恢復(fù)了 BMAL1 的表達(dá)并改善了 IDD 進(jìn)展，進(jìn)一步驗(yàn)證了 Y-27632 和褪黑素在體內(nèi)的治療效果。
圖4 Y-27632和褪黑素恢復(fù)壓縮誘導(dǎo)的大鼠模型中BMAL1的表達(dá)，改善IDD過程。
總之，該研究表明，過度負(fù)荷會(huì)抑制 IVD 生物鐘。此外，通過抑制 RhoA/ROCK 通路上調(diào) BMAL1 表達(dá)可減輕壓縮誘導(dǎo)的 IDD。這些結(jié)果為 IDD 的發(fā)展提供了新的見解，并為IDD的預(yù)防提供了新的治療策略。
參考文獻(xiàn)：Wang D, Peng P, Dudek M, Hu X, Xu X, Shang Q, Wang D, Jia H, Wang H, Gao B, Zheng C, Mao J, Gao C, He X, Cheng P, Wang H, Zheng J, Hoyland JA, Meng QJ, Luo Z, Yang L. Restoring the dampened expression of the core clock molecule BMAL1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration. Bone Res. 2022 Feb 25;10(1):20. doi: 10.1038/s41413-022-00187-z. PMID: 35217644; PMCID: PMC8881495.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35217644/
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