寡核苷酸的應(yīng)用盤點(diǎn)及其固相合成步驟詳解

寡核苷酸合成是許多分子生物學(xué)應(yīng)用的基礎(chǔ)，包括聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)、基因編輯、DNA 測序和基因治療。寡核苷酸主要是用固相合成方法制造的。目前，固相合成方法已經(jīng)發(fā)展到允許合成數(shù)公斤數(shù)量的寡核苷酸用作藥物分子 (如反義寡核苷酸)。固相化學(xué)合成是由 Robert Bruce Merrifield 在 20 世紀(jì) 60 年代發(fā)明的，其重要性使得他在 1984 年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。此外，固相合成方法也廣泛應(yīng)用于多肽合成、寡糖合成和組合化學(xué)等領(lǐng)域。

寡核苷酸是通過磷酸二酯基團(tuán)連接在一起的核苷類線性聚合物。想要了解寡核苷酸合成過程，首先需要了解它的組成單體核苷酸和核苷的結(jié)構(gòu)。

核苷由一個(gè)堿基和一個(gè)糖組成。核苷酸則有一個(gè)額外的磷酸基。核苷、核苷酸和五個(gè)天然堿基的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示[1]。通過磷酸二酯基團(tuán)連接將一個(gè)核苷的 3'-羥基連接到下一個(gè)核苷的 5'‐羥基，從而形成核酸鏈。

圖 1. 核苷酸、核苷和堿基的結(jié)構(gòu)^[1]。


▐  寡核苷酸引物和探針
合成寡核苷酸最普遍的用途是用作探針和引物。作為引物，寡核苷酸通常用于引發(fā)酶促反應(yīng)，以生成短或長靶序列的數(shù)百萬至數(shù)十億個(gè)副本。眾所周知的例子是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 或 Sanger 測序方法。寡核苷酸引物的應(yīng)用包括 DNA 測序、基因表達(dá) (Real Time PCR)、基因克隆和分子診斷。作為探針，寡核苷酸用于鑒定以及結(jié)合特定的 DNA 或 RNA 靶序列，以確認(rèn)該序列在特定樣本中的存在。使用寡核苷酸探針的應(yīng)用包括 Northern 印跡 (用于 RNA)，Southern 印跡 (用于 DNA)，或熒光原位雜交技術(shù) (FISH，可以檢測結(jié)合了熒光探針的 DNA 區(qū)域或 RNA 在染色體或其他細(xì)胞器中的定位)。

目前就有文章報(bào)道可以利用設(shè)計(jì)的 FISH 探針 (CoronaFISH) 可視化新冠病毒SARS-CoV-2 的 RNA (圖 2)，作為微陣列中的熒光基團(tuán)偶聯(lián)序列，可檢測基因表達(dá)的變化，或者用于篩選遺傳疾病或鑒定特定病原體 (分子診斷)。

圖 3. 熒光核酸適配體發(fā)光示意圖^[3]。
▐  寡核苷酸治療/基因治療
在治療應(yīng)用中，反義寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides, ASOs)，小干擾 RNA (Small interference RNA, siRNA)，微小 RNA (Micro-RNA, miRNA) 和核酸適配體 (Aptamers) 等可以通過堿基互補(bǔ)配對原則與 DNA、mRNA 或者 pre-mRNA 配對，并通過一系列過程調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如 RNA 干擾，RNase H 介導(dǎo)的靶基因降解和剪接調(diào)制等[4]。寡核苷酸療法在精確醫(yī)療方面的潛力激發(fā)了人們將寡核苷酸藥物應(yīng)用于癌癥、心血管疾病和罕見疾病治療的熱情。目前，涉及多個(gè)疾病領(lǐng)域的 18 種寡核苷酸類藥物 (包含退市藥物) 已獲得批準(zhǔn)上市。
表 1. 已批準(zhǔn)上市的寡核苷酸藥物^[1][2]。

























固相合成方法是將核苷亞磷酰胺單體按照特定順序偶聯(lián)到固體載體上。核苷亞磷酰胺單體是固相合成的構(gòu)建基塊，在合成時(shí)將核苷亞磷酰胺單體按照特定順序偶聯(lián)到固體載體上。其中 2'/5'-OH 和雜環(huán)氨基被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)以防止合成過程中的副反應(yīng)。圖 2 顯示了亞磷酰胺單體的結(jié)構(gòu)以及常見的保護(hù)基團(tuán)[1]。保護(hù)基團(tuán)被設(shè)計(jì)成在不同的 pH 值下選擇性地去除。選擇性地去除保護(hù)基團(tuán)，使所需要的官能團(tuán)顯露出來，保證了反應(yīng)選擇性的控制。

圖 4. 核苷亞磷酰胺單體和常用保護(hù)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)^[1]。

寡核苷酸固相合成方法是一種化學(xué)合成方法，一般是從 3' 向 5' 方向進(jìn)行的，不同于核酸生物合成過程從 5' 向 3' 方向延伸。每個(gè)合成周期延長一個(gè)核苷酸。

圖 5. 寡核苷酸的固相合成過程^[1]。  

1. 脫保護(hù)基團(tuán)：在寡核苷酸合成之前，用三氯乙酸 (TCA) 脫去連接在固相載體上的核苷 5'-DMT 保護(hù)基團(tuán)，獲得游離的 5'-OH 基團(tuán)，以供下一步縮合反應(yīng)。2. 活化和偶聯(lián)：將過量核苷亞磷酰胺單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，核苷亞磷酰胺單體的二異丙基氨基團(tuán)被活化劑質(zhì)子化，與游離的 5'-OH 發(fā)生親和反應(yīng)，縮合并脫去四唑，從而形成磷酸三酯鍵，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈延長一個(gè)堿基。3. 氧化：在偶聯(lián)反應(yīng)過程中形成的亞磷酸三酯是不穩(wěn)定的，必須在下一個(gè)循環(huán)開始之前將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。需要氧化試劑將亞磷酸三酯轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的磷酸三酯。最常使用的氧化試劑是碘溶于四氫呋喃/吡啶/水的溶液。所得磷酸三酯是由 2-氰基乙基保護(hù)。氰基乙基基團(tuán)防止后續(xù)合成循環(huán)中磷酸三酯發(fā)生其他反應(yīng)。偶聯(lián)步驟對水分敏感，在下一次偶聯(lián)之前，必須用乙腈洗滌除去殘留的水。4. 加帽：加入的核苷亞磷酰胺單體與預(yù)先連接在載體上的核苷無法實(shí)現(xiàn) 100% 的反應(yīng)。這意味著預(yù)先連接在載體上的核苷仍然會(huì)有一些未反應(yīng)的游離的 5'-OH 基團(tuán)。如果不加以控制，這些 5'-OH 基團(tuán)將參與下一個(gè)偶聯(lián)步驟。這樣產(chǎn)生的寡核苷酸將缺少一個(gè)堿基。因此，需要將剩余的 5'-OH 基團(tuán)封閉。常用的加帽試劑有乙酸酐和 N -甲基咪唑 (NMI)。之后，每個(gè)堿基重復(fù)這個(gè)循環(huán)一次，最終產(chǎn)生所需的寡核苷酸。

相關(guān)服務(wù)

• siRNA 合成：提供單基因套裝 (3 保 1) 和 siRNA 文庫。

• miRNA 合成：提供 miRNA mimics 和 miRNA inhibitors 文庫。

• 引物/基因定制合成：支持提供多樣的化學(xué)修飾 (如鎖核酸 LNA，硫代磷酸化，氟代，2’-OMe，2’-MOE 等) 和熒光標(biāo)記 (CY3，CY5，和 FAM 等)。

• 寡核苷酸偶聯(lián)：可偶聯(lián) PEG、脂質(zhì)、小分子化合物、或多肽等。

[1] Pourshahian S. THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES, IMPURITIES, DEGRADANTS, AND THEIR CHARACTERIZATION BY MASS SPECTROMETRY. Mass Spectrom Rev. 2021;40(2):75-109. 
[2] Rensen E, et al. Sensitive visualization of SARS-CoV-2 RNA with CoronaFISH. Life Sci Alliance. 2022;5(4):e202101124. 
[3] Neubacher S, et al. RNA Structure and Cellular Applications of Fluorescent Light-Up Aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(5):1266-1279.
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