新靶點、武裝化or邏輯門控：探索CAR-T在實體瘤治療中的新策略

腫瘤免疫學(xué)作為近年來備受矚目的研究領(lǐng)域，正以其迅猛的發(fā)展態(tài)勢引領(lǐng)著細(xì)胞療法的繁榮。自2017年諾華的Kymriah獲美國FDA批準(zhǔn)上市以來，全球共有11款CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)品獲批上市，其中5款為國內(nèi)上市。

據(jù)沙利文分析，2021~2025年全球CAR-T市場預(yù)計將以47%的CAGR增長到80.3億美元，并將以21%的CAGR增長到2030年的211.4億美元，而中國2030年的CAR-T市場規(guī)模則有望達(dá)到289億元。這得益于上市CAR-T療法在血液瘤治療中取得的顯著成效，CD19、BCMA兩大熱門靶點實現(xiàn)了精準(zhǔn)打擊。然而，當(dāng)我們將視線轉(zhuǎn)向?qū)嶓w瘤時，情況就變得復(fù)雜起來。


◀︎來源：沙利文
 
實體瘤往往是個堅實的團(tuán)狀物，豐富的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和血管還會包裹它，形成了天然厚實的物理屏障，CAR-T細(xì)胞往往難以浸潤。同時，實體瘤會抑制某些趨化因子的分泌，影響T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的遷移。面對腫瘤微環(huán)境（TME）的低pH、低氧、高滲透特性，CAR-T細(xì)胞的存活能力與殺傷力被極大的削弱。

并且，實體瘤中的腫瘤特異性抗原（TSA）很少，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤高表達(dá)靶點多為腫瘤相關(guān)抗原（TAA），在正常組織中也有少量表達(dá)，且具有高度異質(zhì)性，導(dǎo)致安全有效的實體瘤靶點十分稀缺。
面對占比90%以上的實體瘤，CAR-T療法存在巨大的臨床需求。隨著CAR-T研發(fā)的持續(xù)深入，針對實體瘤的解決方案也逐漸豐富，比如多樣化的靶點選擇、武裝化的CAR-T改造、新穎的邏輯門控設(shè)計，既是細(xì)胞治療行業(yè)競爭的重要突破口，也是克服實體瘤挑戰(zhàn)的關(guān)鍵“密鑰”。
    
 
探尋實體瘤靶點，誰將兼具有效性與安全性

合適的實體瘤靶點能夠有效提高CAR-T細(xì)胞特異性，避免殺傷機體的健康組織。近年來，Claudin18.2的靶向藥物在胃癌等惡性實體瘤的治療中展現(xiàn)出了卓越療效，不僅安全可靠，且患者耐受性良好，已被視為胃癌、胰腺癌等實體腫瘤免疫治療領(lǐng)域的新星。
 

◀︎來源：實體瘤免疫細(xì)胞療法的全球競爭格局分析報告，數(shù)據(jù)統(tǒng)計截止2024.3.1

2024年2月，國際知名期刊《Front Immunol》刊登了一則關(guān)于靶向Claudin18.2的CAR-T細(xì)胞療法治療晚期胰腺癌患者，并達(dá)到完全緩解的病例報告，引起行業(yè)的廣泛關(guān)注。
 
在Claudin18.2這樣的經(jīng)典實體瘤靶點之外，對新靶點的探索也從未停止。2023年10月末，Chimeric Therapeutics宣布，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)其全球首款CDH17靶向的CAR-T細(xì)胞療法CHM 2101的IND申請，預(yù)計將在2024年開展一項針對晚期結(jié)腸直腸癌、胃癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的多中心1期臨床試驗。
 
這些進(jìn)展將激發(fā)研發(fā)人員對CAR-T的進(jìn)一步研究，以開發(fā)靶向一些類似的先前未被重視的TAA。
 
 
CAR-T“武裝化”，應(yīng)對腫瘤微環(huán)境

工程化修飾CAR-T細(xì)胞促使其分泌刺激因子或PD-1是一個具有前景的研究方向。
去年年初，強生旗下Janssen Biotech與Simcha達(dá)成一項合作，強生將把Simcha的抗誘餌白細(xì)胞介素-18（DL-18）技術(shù)融入選定的CAR-T細(xì)胞療法候選產(chǎn)品中。IL-18在CAR-T細(xì)胞中表達(dá)能夠增強CAR-T細(xì)胞增殖和抗腫瘤活性，同時還可減少CAR-T細(xì)胞的使用量及全身給藥的副作用。IL-18還可能對各種類型的腫瘤具有廣泛的活性，包括免疫原性強的“熱”腫瘤和對免疫治療有抵抗性的“冷”腫瘤。
今年《NEJM》上發(fā)表的一篇研究論文也展現(xiàn)了一種創(chuàng)新的聯(lián)用武裝策略，研究者將CAR-T細(xì)胞療法和雙特異性抗體這兩種獨立的癌癥治療策略結(jié)合起來，讓靶向EGFRvIII的CAR-T細(xì)胞表達(dá)并分泌靶向野生型EGFR的T細(xì)胞接合抗體分子（TEAM）。在該產(chǎn)品的1期臨床試驗中，3名患有復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者在接受CARv3-TEAM-E T細(xì)胞療法治療后，腫瘤在幾天內(nèi)就出現(xiàn)了顯著消退，其中1名患者的腫瘤近乎完全消失。
 

◀︎來源：《NEJM》
 

邏輯門控：雙保險提升安全性

面對大多數(shù)實體腫瘤靶抗原與正常細(xì)胞共享所產(chǎn)生的毒副作用，研究人員試圖應(yīng)用布爾邏輯門控（Boolean Logic Gate, 包含AND,OR,NOT）方法對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行脫靶毒性預(yù)防。
 

◀︎邏輯門CAR-T細(xì)胞的原理 （圖片來源：參考資料[4] ）

在來自于斯坦福大學(xué)在《NATURE》上發(fā)表的“CAR-T cell design: approaching the elusive AND-gate”一文中，作者設(shè)計了一種基于AND的邏輯門控細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)（LINK CAR），使之可以保護(hù)只表達(dá)一種目標(biāo)抗原的正常組織，擴大CAR-T細(xì)胞靶向的分子范圍，在實體瘤的治療中能夠提高特異性和安全性。
 
 
多重精準(zhǔn)檢測
助力實體瘤CAR-T行穩(wěn)致遠(yuǎn)

這些新的技術(shù)探索極有可能為腫瘤治療領(lǐng)域帶來了革命性的變革，為患者提供新的希望與可能性。然而，這些創(chuàng)新性的治療策略發(fā)展也對臨床前研發(fā)階段中的多個關(guān)鍵指標(biāo)，尤其是細(xì)胞表型檢測、殺傷功能的即時性與持久性，以及脫靶毒性等方面，提出了新的挑戰(zhàn)和迫切的需求。

一  細(xì)胞表型的精準(zhǔn)檢測提高治療效果

在針對實體瘤CAR-T細(xì)胞療法的研究中，對新興細(xì)胞表型地不斷探索，不僅可以揭示細(xì)胞的生物學(xué)特性，還有助于開發(fā)新型的細(xì)胞治療策略。通過掌握細(xì)胞表型的規(guī)律，甚至可能干預(yù)細(xì)胞與宿主環(huán)境的相互作用，從而提高細(xì)胞治療的效果。

T細(xì)胞的體外擴增是CAR-T等過繼細(xì)胞療法生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵步驟。在賽多利斯發(fā)布的“An Optimized, Multiplexed Assay for Screening Ex Vivo Conditions which Increase Memory T Cell Frequency” 一文中，研究表明：在體外T細(xì)胞擴增過程中，讓T細(xì)胞產(chǎn)物中產(chǎn)生更高比例的Tscm和Tcm對于細(xì)胞治療的顯著臨床改善至關(guān)重要。而傳統(tǒng)的檢測方法需要在不同平臺上運行多個分析過程才能確認(rèn)不同種類細(xì)胞的各項關(guān)鍵參數(shù)，不僅效率低下，還會大量消耗寶貴的樣品。

因此研究人員在T細(xì)胞表型和功能分析監(jiān)測中應(yīng)用了賽多利斯的iQue® 高通量流式細(xì)胞儀，該設(shè)備具有較寬的固定動態(tài)范圍，可在不同階段對記憶型T細(xì)胞表型和功能進(jìn)行空間和時間的分析，避免不同時間點的差異，從而增強數(shù)據(jù)完整性。

此外，iQue® 可以實現(xiàn)高通量、多功能的細(xì)胞因子分析。在文章中，研究人員同時進(jìn)行IFN和IL-10分泌情況的定量分析和表型分析來評估細(xì)胞功能，并且使用了來自三個供體的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，在14 種不同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選研究。這種一站式的分析方法不僅提高了篩選研究效率，還能提供更為全面和深入的生物學(xué)洞察。
 

▲iQue® 分析結(jié)果顯示記憶型T細(xì)胞頻比例變化（圖片來源：參考資料^[5]）
 

二  高效、精準(zhǔn)的殺傷力，是各類創(chuàng)新策略的殊途同歸

腫瘤微環(huán)境嚴(yán)重削弱了CAR-T的殺傷力，而殺傷力直接決定了其治療癌癥的效果。可以說，CAR-T細(xì)胞高效、精準(zhǔn)地殺傷腫瘤細(xì)胞是各類創(chuàng)新策略的殊途同歸。為此，研究者在探尋更安全的實體瘤靶點與邏輯門開關(guān)等策略。然而創(chuàng)新策略能否真正奏效，還需檢測來驗證。

美國費城兒童醫(yī)院的研究人員以神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為研究對象，篩選出了特異存在于腫瘤細(xì)胞表面的多肽，以這些多肽為靶點的CAR-T稱為PC-CAR，并選擇一種源自PHOX2B的未突變的神經(jīng)母細(xì)胞瘤肽為靶點，使用Octet® 分子互作分析系統(tǒng)測得其與PHOX2B親和力為13nM。

隨后，研究人員運用Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)來檢測免疫細(xì)胞的殺傷活力。在殺傷實驗中，加入Caspase 3/7 紅色熒光染料后，Incucyte® 可對細(xì)胞進(jìn)行實時、動態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測分析，并通過高分辨率紅色熒光面積和綠色熒光面積直觀得出信息。紅色熒光面積升高快，綠色熒光（靶點細(xì)胞即腫瘤細(xì)胞）下降快，則代表殺傷效果越大，非常直觀。

同時，集成式軟件可以簡化數(shù)據(jù)分析，快速獲得結(jié)果，并生成可供發(fā)表的圖表和繪圖。從下圖可以看出，Incucyte® 的分析數(shù)據(jù)顯示，PC-CAR對SKNAS膠質(zhì)瘤細(xì)胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，有望成為攻克實體瘤的有效靶點。
 

▲ Incucyte® 實時活細(xì)胞成像（圖片來源：參考資料^[6]）
a左圖為PC-CAR對SKNAS膠質(zhì)瘤細(xì)胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，a右圖為PC-CAR對其他腫瘤細(xì)胞（不呈遞PHOX2B）的殺傷則不明顯；b圖從靶細(xì)胞動態(tài)增殖水平來觀察，發(fā)現(xiàn)PC-CAR對SKNAS等膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯。
 
 
三  控制脫靶毒性：安全性的重要防線

控制脫靶毒性是細(xì)胞療法研發(fā)中對安全性的重要考驗，尤其是面對靶點多為腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的實體瘤。CAR-T在攻擊實體瘤時，存在攻擊到正常細(xì)胞的風(fēng)險，導(dǎo)致脫靶毒性，不僅降低治療效果，還會帶來嚴(yán)重的副作用。因此，在臨床前研發(fā)階段，研究人員需要深入探索脫靶毒性的發(fā)生機制，并開發(fā)有效的預(yù)防和減輕脫靶毒性的策略。在驗證邏輯門CAR-T的殺傷力與脫靶效應(yīng)時，也有研究者運用了Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)作為“檢測神器”。

2022年4月27號，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Crystal L. Mackall教授課題組在《Cell》雜志上報道了一種名為SNIP的高性能藥物可調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可利用FDA批準(zhǔn)的一款小分子來調(diào)節(jié)CAR-T活性。研究人員使用Incucyte® 快速準(zhǔn)確地評估了不同版本的SNIP CAR-T針對靶細(xì)胞的殺傷活性，以及藥物對SNIP CAR-T細(xì)胞的調(diào)控活性。
 

▲ SNIP工作機理（圖片來源：參考資料^[7]）

如下圖所示，Incucyte® 的分析結(jié)果顯示，SNIP CAR-T細(xì)胞平臺提供了可靠的安全開關(guān)，降低了CAR-T細(xì)胞的脫靶毒性，SNIP系統(tǒng)在Off狀態(tài)下沒有明顯的“泄露”活性，一旦被激活則具有更強和更快的腫瘤殺傷動力學(xué)。在ON狀態(tài)下具有腫瘤殺傷活性且強于組成型的CAR-T細(xì)胞，同時其在多種原位實體瘤模型中的療效均優(yōu)于組成型CAR-T細(xì)胞平臺。
 

▲Incucyte® 分析數(shù)據(jù)（圖片來源：參考資料^[7]）
 

四  萬事具備，只待快速放行


除了脫靶效應(yīng)外，CAR-T細(xì)胞治療的安全性與快速準(zhǔn)確的微生物質(zhì)量控制檢測也密不可分。微生物污染可能會導(dǎo)致接受者危及生命的感染，因此無菌檢查是任何細(xì)胞治療產(chǎn)品的放行檢測中的關(guān)鍵組成部分�？焖�、準(zhǔn)確、高效的檢測方法能為細(xì)胞藥物的安全性提供有力保障。

目前的藥典推薦的無菌檢查方案需要14天才能確定排除污染，這對于有效期短的細(xì)胞療法藥品太久，更何談那些用于治療晚期病人的自體細(xì)胞療法藥品。因此，市場對不依賴于微生物生長的快速檢測方法的需求與日俱增。

有研究者使用人外周血單核細(xì)胞（HPBMC）、Jurkat 細(xì)胞和中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞作為代表性背景模型，評估了Microsart® ATMP 提取試劑盒和Microsart®  ATMP 細(xì)菌/真菌/支原體測定快速檢測試劑盒在高密度細(xì)胞培養(yǎng)物中的檢測能力。

結(jié)果表明，即使在高細(xì)胞背景下，賽多利斯Microsart® ATMP無菌放行試劑盒也可以快速檢測微生物污染，在3小時內(nèi)提供QC結(jié)果，這相比基于培養(yǎng)法的QC放行節(jié)約了90%以上的時間，不僅有助于降低細(xì)胞治療產(chǎn)品的風(fēng)險，保證患者的安全，還能加快治療藥物的臨床可及速度。
 
 

細(xì)胞療法的卓越應(yīng)用，其核心在于對細(xì)胞生產(chǎn)制備與檢測環(huán)節(jié)的精細(xì)控制和高質(zhì)量保障。面對挑戰(zhàn)重重的實體瘤治療，目前急需采用高效、可靠的檢測手段來優(yōu)化升級CAR-T設(shè)計，以提供精確無誤的細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量信息。這不僅有助于細(xì)胞治療產(chǎn)品在臨床前的全面評估，還能確保生產(chǎn)后的標(biāo)準(zhǔn)化檢測得以準(zhǔn)確進(jìn)行。

賽多利斯憑借一系列先進(jìn)的技術(shù)和產(chǎn)品，為CAR-T療法的研發(fā)提供了堅實的后盾，顯著提升了研發(fā)效率，并極大地增強了患者治療的有效性與安全性。展望未來，隨著科技的持續(xù)進(jìn)步，我們期待更多借助先進(jìn)技術(shù)支持的CAR-T療法能夠成功上市，為實體瘤等疾病的治療帶來劃時代的突破，造福廣大患者。