FIDA技術(shù)的應(yīng)用：通過流動誘導(dǎo)分散分析（FIDA）技術(shù)表征構(gòu)象變化
· 蛋白質(zhì) - 小分子相互作表征
· 天然條件和微量樣品檢測
· 同時評估結(jié)合親和力，構(gòu)象變化和絕對大小
介紹
許多生物學(xué)過程通過蛋白與小分子或其他蛋白的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。在許多情況下，這些相互作用會引起構(gòu)象變化，該變化直接調(diào)節(jié)活性或提供新的結(jié)合位點(diǎn)，以促進(jìn)建立高階復(fù)合物。作為模型系統(tǒng)，本次實(shí)驗(yàn)我們使用了細(xì)菌性結(jié)合蛋白超家族的麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）。
MBP是麥芽糖糊精轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的可溶組分，駐留在革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)中，在該細(xì)菌的周質(zhì)中，它可以將其配體（Maltose，Maltotriose和Maltoheptaose）運(yùn)送到膜結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物。MBP的配體結(jié)合位點(diǎn)位于兩個球狀結(jié)構(gòu)域之間。
圖1.（a）MBP（42.5 kDa）Apo狀態(tài)（左，開放）以及與Maltose（360 Dalton）結(jié)合形成的麥芽糖結(jié)合態(tài)MBP（右，關(guān)閉）；（b）MBP的開放式（淺藍(lán)色）和封閉式（淺粉紅色）結(jié)構(gòu)的對比。
材料和方法
該實(shí)驗(yàn)采用FIDA Neo儀器，480 nm LED熒光檢測模塊（FIDABIO ApS）。
1. 耗材：FIDA標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管（i.d.：75 µm，LT：100cm，Leff：84 cm）。
2. 緩沖液：Tris緩沖液pH 7.4（20mm Tris，150mmNaCl，0.05％Tween）。
3. 指示劑：MBP（4.3ug/mL，100nM）， MBP用Atto 488 NHS （Sigma Aldrich）標(biāo)記。
4. 分析物：麥芽糖（O-α-D-Glucopyranosyl-D-glucose），0-1000 µM。
通過用分析物填充毛細(xì)管，然后注射指示劑與分析物共孵育混合物，在400 mbar下流經(jīng)探測器進(jìn)行樣品分析。
結(jié)果
麥芽糖會引起麥芽糖結(jié)合蛋白的構(gòu)象變化。
FIDA技術(shù)提供了對流體動力半徑（Rh）的絕對測量，并用于測量與麥芽糖（0.3 kDa）結(jié)合后ATTO488標(biāo)記的MBP（42.5 kDa）的尺寸變化。如圖2A所示，在25°C下繪制了MBP表觀Rh隨麥芽糖濃度（0-1000 µM）變化的函數(shù)曲線。MBP的Rh從2.88nm降低至2.62nm，對應(yīng)于0.26nm的ΔRh，清楚地表明結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化（圖2A）。結(jié)合數(shù)學(xué)模型，通過流體動力半徑（Rh）變化的數(shù)據(jù)解析，該相互作用親和力KD≈10 µM，與文獻(xiàn)[1,2]報(bào)道一致。在圖2中，顯示了單獨(dú)MBP和MBP-麥芽糖的疊加FIDA信號。在圖2B中，指示劑峰在麥芽糖存在下變窄。利用FIDA 泰勒分散分布圖的峰面積，可同時探測MBP的熒光強(qiáng)度在增加麥芽糖濃度時因MBP與麥芽糖結(jié)合發(fā)生的變化，即結(jié)合相關(guān)熒光強(qiáng)度變化（BRIC，Binding Realted Intensity Change）。它表明，MBP的熒光信號受麥芽糖結(jié)合的影響（圖2B），利用BRIC信號可從第二個維度解析二者親和力常數(shù)KD≈10 µM，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)合測量的正交估計(jì)。
圖2.（A）由FIDA在25°C分析的MBP和麥芽糖之間的相關(guān)結(jié)合曲線。即MBP的Rh隨麥芽糖濃度（0-1000 µM）變化的函數(shù)曲線。（B）與單獨(dú)的MBP（實(shí)線）相比，當(dāng)存在麥芽糖（虛線）時，指示劑峰的原始數(shù)據(jù)曲線變得更窄。
結(jié)論
本文的數(shù)據(jù)顯示了如何使用FIDA技術(shù)對蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化進(jìn)行測量。FIDA通過測量蛋白質(zhì)的流動性半徑（5 µL樣品消耗）來深入評估活性以及局部和全局蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。在一個平臺，同時采用2種方法解析分子互作親和力常數(shù)，正交測量，相互驗(yàn)證。
分子互作與穩(wěn)定性分析系統(tǒng)
FIDA技術(shù)無論在傳統(tǒng)的生物大分子、小分子互作分析，還是三元復(fù)合物，血清、血漿、粗提物中互作分析都有很好的適用性，而且在一些傳統(tǒng)互作技術(shù)具有挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域，例如免純化樣本、脂質(zhì)體、外泌體、GPCR互作分析領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢，F(xiàn)IDA技術(shù)擴(kuò)展了互作方法的應(yīng)用領(lǐng)域，非常有利于實(shí)驗(yàn)平臺進(jìn)行分子互作儀器技術(shù)升級。
FIDA技術(shù)在分子質(zhì)量表征方面同樣優(yōu)秀，一次運(yùn)行只需4微升樣品4分鐘的時間即可獲取多達(dá)8個質(zhì)量參數(shù)，其中流體力學(xué)半徑(Rh)和粘度（Viscosity）為絕對數(shù)值，黏性（Stickiness）是FIDA的獨(dú)家指標(biāo)，聚集和多分散系數(shù)（PDI）為量化參數(shù)。FIDA可以用在任何蛋白相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，包括蛋白質(zhì)控，蛋白穩(wěn)定性篩選、制劑篩選等常規(guī)方向，還可在液-液相分離（LLPS），冷凍電鏡樣本制備質(zhì)控、蛋白表達(dá)體系篩選等領(lǐng)域有很好的解決方案。
產(chǎn)品特點(diǎn)
1. 無固定相：溶液中直接檢測分子相互作用
2. 無標(biāo)記或熒光標(biāo)記
3. 靈敏度：Rh范圍0.5-500nm
4. 分辨率：檢測到＜5%Rh變化
5. 親和力范圍：pM-mM
6. 分析物上樣體積：≤4μL
7. 每個數(shù)據(jù)點(diǎn)8個質(zhì)控參數(shù)
8. 適用于各種樣本類型，包括免純化蛋白、無緩沖液限制
應(yīng)用領(lǐng)域
