質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、提取、鑒定、轉(zhuǎn)染、測定實驗操作詳解

基因研究中常需要通過上調(diào)靶基因的表達(dá)來觀察表型變化。過表達(dá) (Over-Expression，OE) 是上調(diào)基因表達(dá)最常用的方法，其基本原理是將目的基因構(gòu)建到質(zhì)�；虿《据d體中，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)使基因的表達(dá)量增加。

使用質(zhì)粒法過表達(dá)外源基因具有簡便、成本低和實驗體系成熟等優(yōu)點，因此大多數(shù)實驗室會偏向于使用質(zhì)粒法。

今天我們就來聊聊質(zhì)粒提取那些事兒~

質(zhì)粒：一個小型環(huán)狀雙鏈 DNA 分子，存在于細(xì)菌染色體外，能獨立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳。
質(zhì)粒分子小 (0.2-10 KD)，因此便于分離和提取，可以攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)菌、動物細(xì)胞或植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)。

圖 1. 大腸桿菌質(zhì)粒分子結(jié)構(gòu)示意圖。
 

 

接下來，我們以“Parkin 基因過表達(dá)質(zhì)粒和細(xì)胞模型的構(gòu)建”為例詳細(xì)展開[1]！

知識鏈接：

Parkin 是帕金森病的遺傳易感基因之一，其突變和蛋白功能缺陷可導(dǎo)致 PD。早期的研究發(fā)現(xiàn)，Parkin 蛋白在中腦的黑質(zhì)和藍(lán)斑處的神經(jīng)元表達(dá)豐富，而帕金森病人黑質(zhì)的 Parkin 含量明顯降低。
So，上調(diào)一哈，上調(diào)一哈……

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構(gòu)建

▐ 帶有 GFP 標(biāo)記的 Parkin 過表達(dá)質(zhì)粒

質(zhì)粒的構(gòu)建可經(jīng)公司購買得到，一般同時提供陰性對照菌液及質(zhì)粒。

利用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性化載體，PCR 擴(kuò)增制備 Parkin 基因片段，所用擴(kuò)增引物需在其 5' 端添加同源重組序列，使用該引物擴(kuò)增基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物 5' 和 3' 最末端的序列分別與線性化載體兩末端序列完全一致。以線性化載體和基因擴(kuò)增產(chǎn)物配制反應(yīng)體系，進(jìn)行重組反應(yīng)，實現(xiàn)體外環(huán)化。

圖 2. 構(gòu)建的 Parkin 過表達(dá)質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖^[1]。 

GV146：載 體 編 號 ；CMV-MCS-IRES-EGFP-SV40-Neomycin：元件順序；EGFP：熒光標(biāo)記；Kanr：青霉素抗性；MCS：多克隆位點 (Parkin)。

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轉(zhuǎn)化擴(kuò)增

（1）配置 LB 肉湯培養(yǎng)基及含 AGAR 的培養(yǎng)液 (含瓊脂，用于配制LB固體培養(yǎng)基)，倒平板，接種陰性對照菌液和 Parkin 過表達(dá)菌液于固體培養(yǎng)皿中，并倒置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育 16 h 左右；

（2）然后各挑取一個獨立的、圓形且大小適中的菌落，接種于 5 mL 含抗生素的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃，250 rpm，搖菌 10 h；

（3）從兩種 5 mL 的菌液中各取 1 mL 分別加入至 LB 培養(yǎng)液中，37 ℃，250 rpm，搖菌 14 h。

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抽提和鑒定

擴(kuò)增結(jié)束后可按照質(zhì)粒抽提試劑盒對質(zhì)粒進(jìn)行提取。提取的 Parkin 過表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，進(jìn)行測序 (一般可交由公司完成測序)。將測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對分析，后續(xù)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
質(zhì)粒抽提怎么選？

質(zhì)粒提取的目的是去除 RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA 分開，隨后去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。按得到質(zhì)粒 DNA 的量可將質(zhì)粒抽提方法和試劑盒分為小提，中提，大提。

表 1. 不同質(zhì)粒抽提的比較。 

質(zhì)粒提取最常使用的是堿裂解法。即在強堿性條件下，使質(zhì)粒 DNA 和基因組 DNA 同時從細(xì)胞中釋放出來，并發(fā)生變性而便于純化出來。市售的大多數(shù)試劑盒都是基于堿裂解法原理。堿法抽提適用于小量制備 15 kb 以下的質(zhì)粒 DNA (大于 15 kb 的 DNA 在堿法提取過程中很容易斷裂)。

圖 3. 質(zhì)粒提取過程。 

利用離子去污劑 (如 SDS) 裂解宿主細(xì)胞（細(xì)菌）；利用蛋白酶和 RNase 等，從細(xì)胞中釋放 DNA，去除蛋白等雜質(zhì)；從層析液中吸收、釋放 DNA。如，利用乙醇或者異丙醇沉淀 DNA 去除鹽離子。

堿裂解法制備質(zhì)粒的關(guān)鍵是把握好 SDS-NaOH 處理菌體的時間。如果質(zhì)粒長時間處于堿性環(huán)境，就有可能出現(xiàn)不可逆的變性反應(yīng)，使質(zhì)粒變性，無法進(jìn)行正常的酶切反應(yīng)等實驗，降低終產(chǎn)物品質(zhì)和可用性。
小 M 為大家整理了抽提的主要試劑及注意事項，可自行點贊收藏喔~
表 2. 提取主要試劑、原理與注意事項。

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細(xì)胞培養(yǎng)

小M已做過細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)推文 (詳見往期推文：實驗操作 | 小白第一課！基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)方法及步驟）大家可作為參考，并根據(jù)自己的細(xì)胞常用培養(yǎng)方法開展實驗。

此處以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SH-SY5Y 細(xì)胞株為例[1]：
(1) 用 25 cm2 細(xì)胞透氣培養(yǎng)瓶，含有 10% 胎牛血清和 1% 青鏈霉素的 DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞 (培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO₂)。
(2) 每 1～2 天進(jìn)行換液，細(xì)胞長至 80 %～90 % 時傳代：
① 用吸管吸出舊的培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次，每次 5 mL，每瓶加入 0.5 mL 胰酶，消化 30～60s。顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞收縮、變圓，有少許細(xì)胞開始掉落時，立即用吸管吸出胰酶，加入 5 mL 培養(yǎng)基吹打終止消化，使細(xì)胞從瓶壁上全部脫落，懸浮在培養(yǎng)基中。
② 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 15 mL 離心管中，4 ℃，1000 rpm，離心 5 min。

③ 棄上清，新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并輕輕混勻，根據(jù)細(xì)胞生長密度選擇傳代瓶數(shù)。一周傳代 2～3 次。

(3) 細(xì)胞凍存時，凍存液成分：70% 培養(yǎng)基，20% 胎牛血清，10% DMSO；凍存密度為 1～2×106 個 /管，液氮保存。

圖 4. 傳代流程圖。

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分組

(1) 正常對照組 (C)：正常培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞。
(2) 陰性對照組 (NC)：SH-SY5Y 細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒。 
(3) 過表達(dá)組 (PC)：SH-SY5Y 細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒。

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轉(zhuǎn)染

細(xì)胞鋪板 24 h 后，按照 Lipofectamine 說明書用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 48 h 后，熒光顯微鏡下觀察其 GFP 的表達(dá)情況及統(tǒng)計其轉(zhuǎn)染效率 (對明場及暗場熒光細(xì)胞計數(shù)，得：轉(zhuǎn)染效率 = 暗場熒光細(xì)胞個數(shù) / 明場細(xì)胞個數(shù)；也可通過流式等觀察統(tǒng)計其轉(zhuǎn)染情況)。

結(jié)果顯示，陰性對照組和 Parkin 過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)可觀察到較多的綠色熒光蛋白表達(dá)，而正常組細(xì)胞沒有觀察到，則質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。

圖 5. 轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)^[1]。

A. 正常對照組 (明場)；B. 正常對照組 (暗場)；C. 陰性對照組 (明場)；D. 陰性對照 (暗場)；E. 過表達(dá)組 (明場)；F. 過表達(dá)組 (暗場)。


MCE 轉(zhuǎn)染試劑推薦： 

 

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RT-PCR

▐  實時熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測 EGFP-Parkin mRNA 的表達(dá)水平
大家可根據(jù)購買的試劑盒進(jìn)行操作，小 M 在下方為大家整理了文獻(xiàn)中的操作步驟，供大家參考[1]。

(1) 提取 RNA 及將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA：

• 實驗分組及處理同上，TRIzol 提取細(xì)胞后每管加入 200 µL 氯仿，離心 15 min 后吸取 400 µL 上層水相至新的管中；每管加入 400 µL 異 丙醇，離心 10 min，棄上清；加入 l mL 75 % 的乙醇懸浮沉淀后 離心 5 min，棄上清后晾置并加入 50 µL DEPC 水，吹打混勻， 稀釋后用紫外分光光度計測定 RNA 的濃度。

• 各組取 2 µg RNA 與 1 µL 的 Oligo (dT) 及 DEPC 水混合均勻，放置于逆轉(zhuǎn)錄儀中 變性，65 ℃，5 min；配制反應(yīng)混合物 (每管：5× Reaction Buffer: 4 µL, RiboLock RNase Inhibitor: 1 µL, 10 nM dNTP Mix: 2 µL, RevetAid M-Mulv RT: 1 µL) 每管加入 8 µL 混合物；置于逆轉(zhuǎn)錄儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件為 42 ℃，60 min → 70 ℃，5 min → 4 ℃， -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/span>

（2）PCR 反應(yīng)檢測 EGFP-Parkin mRNA 表達(dá)水平：

• 用 DEPC 水將 cDNA 稀釋 10 倍；分別配制 Parkin 和 β-actin 引物的反應(yīng)體系 (見下表 3)，先加入引物反應(yīng)混合液 (引物可自行設(shè)計或公司購買)，每孔 18 µL， 再加入稀釋的 cDNA，每孔 2 µL，置于實時熒光定量 PCR 儀內(nèi)進(jìn)行檢測。
• 采用 Livak (2-△△CT) 法分析 Parkin 的相對表達(dá)量：△CT = CT_Parkin-CT_β-actin，△△CT = △CT 實驗組 -△CT 對照組，相對表達(dá)量 = 2-△△CT。
  表 3. Parkin 和 β-actin 引物的每孔反應(yīng)體系^[1]。 
  

轉(zhuǎn)染后 SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi) Parkin mRNA 表達(dá)情況：
RT-PCR 結(jié)果顯示，Parkin 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，正常對照組與陰性對照組的 Parkin-mRNA 水平?jīng)]有明顯差異 (P>0.05)；而與正常對照組和陰性對照組相比，Parkin 對照組的 mRNA 表達(dá)量有明顯提高 (P<0.01)。
另外，RT-PCR 的溶解曲線 (Melt Curve) 分析結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性良好，40 個擴(kuò)增循環(huán)中沒有引物二聚體的產(chǎn)生，溶解峰為 79.16 ℃ (圖 6)。

圖 6. 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 SH-SY5Y 細(xì)胞 Parkin-mRNA 的相對表達(dá)情況^[1]。 

A.RT-PCR 的擴(kuò)增曲線 B. 溶解曲線 C. 采用 2 ^{-Δ Δ}CT 法分析各組 mRNA 的相對表達(dá)量，與正常對照組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05

MCE 轉(zhuǎn)染試劑推薦：

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Western Blot

▐  Western Blot 檢測 Parkin 蛋白的表達(dá)水平

有關(guān) Western Blot 的實驗操作，往期小 M 已為大家做過解讀 (詳見往期推文：Western Blot 實驗步驟 + 不可忽視的小細(xì)節(jié))，大家可根據(jù)自己的目的蛋白進(jìn)行實驗參數(shù)的調(diào)整。

文獻(xiàn)參考步驟[1]：
 

(1) 蛋白提取、定量及變性：

BCA 蛋白定量試劑盒提取蛋白并檢測蛋白濃度。提取的蛋白樣品加入 5× loading buffer 和 RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行定量配平，并將配平的蛋白樣品置于 100 ℃ 沸水浴中煮 5 min。
（2）免疫印跡：
① 配膠、灌膠：配制 10 mL 10 % 的分離膠和 5 mL 5 % 的濃縮膠，先后灌入，先配分離膠，再配制濃縮膠，然后 插入 10 孔梳子，待濃縮膠凝固后，將梳子拔出，置于電泳槽中。(或自行購買預(yù)制膠板，進(jìn)行后續(xù)操作)
② 上樣：每孔 30 µg，20 µL，上樣后 100 V 電壓，電泳約 120 min。
③ 轉(zhuǎn)膜：制作 " 三明治 " 夾板并將其放入電轉(zhuǎn) 槽中并加滿電轉(zhuǎn)液；電轉(zhuǎn)槽置于冰上開始電轉(zhuǎn)，100 V 電壓，電轉(zhuǎn) 80 min。
④ 封閉：電轉(zhuǎn)后將膜取出，室溫下置于搖床上封閉 1 h。
⑤ 一抗孵育：用一抗稀釋液將一抗稀釋至適當(dāng)濃度 (1：1000)；室溫下， 搖床上孵育 1 h 后，置于 4 ℃ 冰箱里孵育過夜。
⑥ 二抗孵育：搖床上用 TBST 將膜漂洗 15 min× 3 次。用 0.5 % 脫脂牛奶 -TBST 溶液稀釋二抗至適當(dāng)?shù)臐舛?nbsp;(1：1000) 置于搖床上慢速搖動孵育 1 h。
⑦ 顯影：將膜取出，置于搖床上用 TBST 漂洗 15 min × 3 次。顯影，采用軟件進(jìn)行分析。

 

Western Blot 結(jié)果顯示，正常對照組與陰性對照組的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異 (P>0.05)；過表達(dá)組的 Parkin 蛋白水平較正常對照組和陰性對照組有顯著提高 (P<0.01)，提高了約 60 % (圖 7)。

圖 7. 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi) Parkin 蛋白的相對表達(dá)情況^[1]。

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如何做好細(xì)菌培養(yǎng)？

• 建議統(tǒng)一使用 LB 培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)菌。開始細(xì)菌培養(yǎng)前，最好涂板挑菌培養(yǎng)，并稀釋后做二次培養(yǎng) (培養(yǎng)條件：37℃，300 rpm，培養(yǎng) 12-16 h)。甘油保存的菌可能會產(chǎn)量低或者質(zhì)粒丟失。

• 注意不要做高密度培養(yǎng)，否則會超過純化體系可以承受的范圍，降低質(zhì)粒產(chǎn)率。起始培養(yǎng)體積應(yīng)基于培養(yǎng)細(xì)菌密度，用來提取質(zhì)粒的細(xì)菌的 OD₆₀₀ 建議為 2-3。

 

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 低拷貝質(zhì)粒如何增加產(chǎn)率？

• 在一個細(xì)菌細(xì)胞中只有 5 個以下的相同質(zhì)粒時，該質(zhì)粒是低拷貝質(zhì)粒；當(dāng)在一個細(xì)菌細(xì)胞中可以有幾百個相同質(zhì)粒時則該質(zhì)粒是高拷貝質(zhì)粒。若大提質(zhì)粒或者小提質(zhì)粒的實驗效果不好時，則需要加大提取的菌體量，可進(jìn)行質(zhì)粒中提或者大提。另外，使用去內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒時，也會降低最終得到質(zhì)粒的濃度。

• 氯霉素能夠抑制染色體的復(fù)制，而不抑制質(zhì)粒復(fù)制�？梢栽诘涂截愘|(zhì)粒 (如 pUC19) 的培養(yǎng)過程中添加氯霉素。

 

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 如何提高雜質(zhì)去除率？

• RNA：可以使用 RNase (100 μg/mL) 消化或者用含 25 μg RNase A/mL TE 溶解抽提好的質(zhì)粒。但這些方法也不能徹底去除 RNA。

• 蛋白質(zhì)：主要靠形成不溶的 K-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物、使蛋白質(zhì)共沉淀。大量抽提時，可以將中和后的體系置于 4 ℃ 一段時間，以形成更多的該不溶復(fù)合物，從而使蛋白質(zhì)殘留更少。

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 如何提高獲得的 DNA 濃度？

• 最后加入預(yù)熱的洗脫液或 ddH₂O 時，可先加 30 μL 溶解。離心 后不著急扔掉離心柱，可將離心下的質(zhì)粒再返加入洗脫管洗脫。

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 瓊脂糖電泳鑒定結(jié)果說明

• 多數(shù)情況下會出現(xiàn) 3 條帶。這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體 (沒有復(fù)制完全而連在一起的質(zhì)粒)。

  注：堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性 DNA。

• 有的結(jié)果中會有第 4 條帶。這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是 20-100 kb 的大腸桿菌基因組 DNA 的片斷。這是因為在抽提環(huán)節(jié)中，加入溶液 II 后過度振蕩所致。

• 少數(shù)情況下會出現(xiàn) 7-10 條帶。可能因為一些 DNA 序列特殊，而出現(xiàn)不同程度超螺旋 (超螺旋的圈數(shù)不同，而泳動速度不同) 所致。

[1] Ma Hao jie, et al. Construction of Overexpression Plasmid and the Cell Model. Progress in Modern Biomedicine Vol.18 NO.3 FEB.2018.