免疫機(jī)制的多樣性與TLR4在LPS識別中的關(guān)鍵作用

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)至少存在10種TLRs分子，為何機(jī)體內(nèi)存在多種TLRs？現(xiàn)已研究證實(shí)，這是由于宿主識別不同微生物的需要而形成的免疫機(jī)制，如在果蠅，Toll家族不同成員參與對不同病原菌的防御作用：Toll 主要介導(dǎo)抗真菌反應(yīng)，18-Wheeler拮抗細(xì)菌感染。哺乳動(dòng)物TLRs家族不同成員對微生物及其PAMPs的識別作用也存在相對的特異性。表7-3顯示TLR家族成員不僅識別脂質(zhì)和多糖（如LPS、肽聚糖），而且也與細(xì)菌或病毒DNA、RNA和蛋白質(zhì)作用。
 

TLR4是研究最早、作用也最為明確的TLR分子。除細(xì)菌LPS外，近年來也發(fā)現(xiàn)了其他一些配體，如抗腫瘤藥物泰素﹑熱休克蛋白60（hsp60）等。識別的病原菌主要有革蘭陰性菌、厭氧菌、致密螺旋體。有人認(rèn)為，TLR4還能識別病毒融合蛋白（respiratory scyncytial virus，RSV），但該研究采用的動(dòng)物是C57BL/10ScCr小鼠，這種小鼠體內(nèi)同時(shí)缺失Tlr4和IL-12受體β₂鏈基因。由于1L-12是天然免疫和適應(yīng)性免疫拮抗病毒感染的關(guān)鍵細(xì)胞因子，以及C57BL/10ScCr小鼠對IL-12，無反應(yīng)。因此，TLR4對RSV的識別作用尚待探討。

TLR4雖能識別多種配體，但主要配體是細(xì)菌LPS，同CD14分子一樣，作為一種重要的LPS興奮性受體，在介導(dǎo)革蘭陰性細(xì)菌及其LPS的宿主反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果顯示，將TLR4基因轉(zhuǎn)入不表達(dá)TLR4的細(xì)胞內(nèi)，可使不具有LPS反應(yīng)的細(xì)胞具有一定的LPS反應(yīng)性。相反，將LPS反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的TLR4基因進(jìn)行突變或缺失，細(xì)胞則出現(xiàn)LPS低反應(yīng)性或耐受。抗TLR4抗體能抑制不同血清型腸道桿菌LPS刺激人THP-1細(xì)胞釋放TNFα的作用，但對肽聚糖、熱滅活金黃色葡萄球菌等無抑制作用。

此外，TLR4胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的點(diǎn)突變也顯示與人呼吸道LPS低反應(yīng)性有一定的內(nèi)在聯(lián)系。骨髓移植病人自身或供者tlr4基因胞外區(qū)缺陷人群中，骨髓干細(xì)胞移植后革蘭陰性膿毒癥的發(fā)生率為16.7%，而正常TLR4的受者中，其感染的發(fā)生率為6.6%，提示TLR4 胞外區(qū)的突變可增加內(nèi)毒素血癥的危險(xiǎn)性。

然而，最能說明TLR4作為LPS重要受體的是近年來關(guān)于Lps基因的研究。1978年，James Watson首次提出小鼠體內(nèi)可能存在控制LPS反應(yīng)的特定基因，取名為Lps，認(rèn)為該基因可能有兩個(gè)等位基因：即Lps^d（defective response〉和Lpsⁿ （normal response）。三種天然LPS低反應(yīng)小鼠品系C3H /HeJ、C57BL/10ScCr和C57BL/10ScN的Lps等位基因?yàn)長ps^d，表現(xiàn)為對LPS刺激的耐受性。James Watson等通過基因作圖將Lps基因座定位于小鼠4號染色體上。20世紀(jì)90年代以來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，先后有多個(gè)研究小組采用定位克隆策略，對Lps基因座重新進(jìn)行精細(xì)作圖，繪制出圍繞Lps基因座染色體區(qū)的高分辨連鎖圖，最終將Lps基因座定位于0.9 cM、1.7~2.6Mb長的片段內(nèi)。

為了進(jìn)一步明確Lps基因座內(nèi)的候選基因及其編碼蛋白，1998年P(guān)oltorak等對該重要區(qū)域進(jìn)行高密度測序（近4萬次），以及利用外顯子捕獲﹑選擇性原位雜交和定位克隆等技術(shù)，在其區(qū)域內(nèi)鑒別出多個(gè)基因，如TLR4基因、鋅脂蛋白基因、Tera同構(gòu)體基因、大部分Pappa基因序列（編碼一種分泌型金屬蛋白酶）、芳香乙酰胺脫乙酰基酶基因和astrotactin同構(gòu)體基因，Tlr4是唯一與LPS作用有關(guān)的基因，Tlr4全長基因都位于Lps基因座內(nèi)。其他學(xué)者也獲得同樣結(jié)果。

進(jìn)一步研究顯示，C3H/HeJ小鼠Tlr4cDNA的第2342位，即第3個(gè)外顯子上出現(xiàn)一個(gè)堿基顛換：C→A。在LPS反應(yīng)品系小鼠基因組DNA中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的堿基突變。此外，C3H/HeJ、C3H/HeN、C57BL/10ScSn小鼠巨噬細(xì)胞均能檢測出Tlr4 mRNA，但不能檢測出C57BL/10ScCr小鼠巨噬細(xì)胞的Tlr4 mRNA。上述結(jié)果說明，C3H/HeJ小鼠Tlr4為點(diǎn)突變，其突變并不影響Tlr4的轉(zhuǎn)錄，C57BL/10ScCr小鼠Tlr4基因則為完全缺失，即為無效等位基因（null allele），有74723個(gè)核苷酸缺失，這包括了該基因的所有三個(gè)外顯子，因而出現(xiàn)隱性突變。由于Tlr4位于Lps內(nèi)，兩種 LPS耐受株小鼠的Tlr4基因均發(fā)生錯(cuò)義突變（missense mutation）或缺失，進(jìn)一步證實(shí)Tlr4基因就是Lps的最佳候選基因。

進(jìn)一步研究顯示，T1r4基因的突變具有重要的功能意義。C3H/HeJ小鼠Tlr4基因第3個(gè)外顯子上的點(diǎn)突變雖不影響該基因的轉(zhuǎn)錄，但因其密碼子的變化，使蛋白氨基酸序列上第712位高度保守的脯氨酸（proline）變?yōu)榻M胺酸（histidine）。該區(qū)域正為蛋白質(zhì)的胞漿區(qū)，該胞漿區(qū)為進(jìn)化中最保守的結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)域的完整性對于通過TLRs介導(dǎo)的LPS信號至關(guān)重要。這種氨基酸殘基的替換改變了TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，進(jìn)而破壞了與下游分子蛋白一蛋白間的相互作用，從而表現(xiàn)出對LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共顯性抑制作用。C57BL/10ScCr小鼠因Tlr4基因完全缺失，不能表達(dá)TLR4蛋白，因而出現(xiàn)對LPS反應(yīng)的隱性消失（recessive abolition）。由此可見，C3H/HeJ和C57BL/10ScCr的突變表型分別與Tr4點(diǎn)突變或基因缺失非常吻合。