SpheroONE自動化3D球體分選技術(shù)助力藥物篩選
瀏覽次數(shù):600 發(fā)布日期:2024-7-2
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CELLENION自動化3D球體分揀、分離和分選
「 摘要」
spheroONE®是一種獨特的大顆粒分離、分選和噴點儀器。該儀器結(jié)合了精密的低容量噴點、基于圖像的玻璃噴點毛細(xì)管內(nèi)顆粒跟蹤和自動化功能,能夠高效地分離和分揀球體、類器官和類腫瘤體等細(xì)胞聚集體。分離過程通?稍跀(shù)分鐘內(nèi)將 92% 以上的單個球形顆粒分配到目標(biāo) 96 孔板的每個孔中。此外,用戶還可以隨時定義分離參數(shù)(即顆粒的直徑和伸長率),從而根據(jù)細(xì)胞聚集體的形態(tài)對不同亞群的細(xì)胞聚集體進(jìn)行分揀。spheroONE® 為3D細(xì)胞模型標(biāo)準(zhǔn)化和自動化處理提供了前所未有的手段。
「簡介 」
3D球體因其固有的臨床相關(guān)性而在高通量篩選中獲得了極大的關(guān)注(Nunes,2018)。這與實體腫瘤建模尤其相關(guān),因為3D球體具有空間結(jié)構(gòu)、擴散障礙、差異基因表達(dá)和耐藥性等特征,使其成為抗腫瘤藥物篩選的首選模型(Costa,2016)。為了進(jìn)行可重復(fù)的檢測,根據(jù)球體的大小、形態(tài)和內(nèi)部組織預(yù)選球體至關(guān)重要。迄今為止,還沒有可行的方法來分離和操縱細(xì)胞聚集體(Singhera,2017 年)。通過融合關(guān)鍵技術(shù),即精確的納升體積按需點滴、機器人技術(shù)、成像和軟件自動化,Cellenion 開發(fā)出了用于分揀、分離和點滴3D球體、類器官和類腫瘤體等大顆粒的創(chuàng)新平臺--SpheroONE®。本文通過展示我們從異質(zhì)群體中分離出顯示用戶定義尺寸和形態(tài)特征的球狀體的能力,突出了該平臺的功能。
「 材料與方法 」
自動大顆粒分離和噴點
在以下實驗中使用了一臺配備精密納升體積按需滴定系統(tǒng)(Nano Dispense Capillaries,NDC,約Ø = 400 µm)、光學(xué)系統(tǒng)(包括高分辨率相機、暗場照明模塊)、x-y-z軸系統(tǒng)和專用軟件的spheroONE®儀器。
細(xì)胞培養(yǎng)
HEK 細(xì)胞在添加 10% FBS 和抗生素(青霉素/鏈霉素)的 DMEM 中培養(yǎng)。HEK 球形細(xì)胞是在超低附著力(ULA)燒瓶(Nunclon sphera,Thermo Fisher)中通過液體覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)制備的,培養(yǎng)過程恒定攪拌(100-150 轉(zhuǎn)/分)3-7 天。培養(yǎng)基每隔一天更換一次。
樣品制備
樣品(3 毫升)含有 PBS 溶液中的球體懸浮液(500-1500 個球體/毫升),在吸收前對其進(jìn)行過濾(Uberstrain,70 µm),以去除細(xì)小的細(xì)胞碎片。在無菌條件下,將濾過的樣品裝入專用的加壓樣品容器中,然后轉(zhuǎn)移到spheroONE® 中進(jìn)行處理。
活/死檢測
分離和分配后4小時,通過熒光成像和分析使用 Hoechst33342和碘化丙啶(PI)染色的球體分析來評估細(xì)胞活力。
結(jié)果與討論
單球體分離
分離過程示意圖見圖1。在隔離之前,為確保精確隔離,NDC 被放置在儀器的攝像頭前,并執(zhí)行自動mapping程序。mapping程序(在連續(xù)分配液滴的同時,對NDC內(nèi)部多達(dá)100個物體進(jìn)行約100次跟蹤)可精確確定噴射區(qū)(圖1a),該區(qū)域與下一個待分配液滴的體積所填充的區(qū)域相對應(yīng)。為了考慮到在軸運動過程中,噴點毛細(xì)管內(nèi)的顆粒可能會發(fā)生沉淀,軟件設(shè)置了一個沉淀區(qū)(圖 1a)。mapping完成后,SpheroONE® 執(zhí)行的分離過程如下(圖 1b):(i) 將毛細(xì)管置于攝像頭前,(ii) 在制作下一個液滴之前采集圖像、(iii)對圖像進(jìn)行處理和分析,(iv)軟件自動確定下一個液滴是否含有符合用戶定義的分離參數(shù)的單個球體(在這種情況下,軸系統(tǒng)將 NDC 移到下一個目標(biāo)孔上方以分配包含球體的液滴然后返回相機前),或者不含有球體(在這種情況下,液滴直接分配到回收管中)
圖1
分離過程。a. 納米噴點毛細(xì)管圖像及噴射區(qū)和沉淀區(qū)示意圖。b. 分離過程示意圖。分離情況:在噴射區(qū)檢測到單個顆粒,沉淀區(qū)無顆粒。丟棄情況:在噴射區(qū)未檢測到顆粒(左)或在噴射區(qū)檢測到多個顆粒(中),且在沉積區(qū)檢測到顆粒(右)。
c. 在暗場照明下NDC中細(xì)胞聚集體(白色箭頭)的
spheroONE®圖像。
為說明分離過程,將HEK球體懸浮液(每毫升PBS中含有500-1500個球體)加載到spheroONE®(圖 2a)。樣品儲存器被加壓(約200 mBar),并使用專用程序任務(wù)進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)處理,以確保管道中充滿溶液且無任何氣泡。設(shè)置檢測和分離參數(shù),并執(zhí)行mapping以確定噴射區(qū)。將一個預(yù)裝了50µL培養(yǎng)基的96U型底孔板放在目標(biāo)板支架上。開始分離運行,在目標(biāo)孔板的每個孔中分離和分配單個球體(圖2b)。通過設(shè)置定義的大小和伸長參數(shù),可對子群體進(jìn)行排序(圖 2c)。
圖2
球體分離。a. 分選和分離前球狀體懸浮液的顯微圖像。
b. 分離到單個孔中的球體拼接圖像。
c. 分離球體(粉紅色點)和排除球體(藍(lán)色點)的大。ㄖ睆剑┖托螤睿ɡ欤┑膱D形表示。(比例尺 = 500µm)。
分離過程具有很高的可重復(fù)性,這一點可以從四次獨立分離運行中實現(xiàn)的分離準(zhǔn)確性看出(圖 3)。
平均而言,單個球體的準(zhǔn)確率達(dá)到 91%(CV < 2%)。
圖3
按大小對球體進(jìn)行分類
為了進(jìn)一步說明SpheroONE®按大小分離球體的能力,我們使用不同的分離參數(shù)進(jìn)行了多次額外的運行。在第一次分離運行中,分離出直徑為100-500 微米的球體。第二次運行使用的參數(shù)稍窄,分離出直徑為 350-500 微米的最大球體。第三次運行分離出直徑為 200-250 微米的較小球體。
分離后,使用明場視野顯微鏡對球體進(jìn)行成像,并根據(jù)這些圖像測量其平均直徑。不出所料,第一次分離得到了高度異質(zhì)的單個球體,測量直徑從160微米到 669 微米不等(圖 4a、d)。第二次運行成功分離出直徑為277至550微米的最大球體(圖 4b、d)。第三次實驗分離出高度均勻的球體,直徑從151微米到 238微米不等(圖 4c、d)。顯微鏡測量的直徑與SpheroONE®暗場視野圖像之間存在差異的原因是由于光擴散在球體外緣形成光暈,使用暗視野照明時對球體直徑產(chǎn)生高估。
圖4
按大小排序的球體。a. 排列好的球體的顯微圖像,直徑范圍為100-500微米。b. 排列好的球體的顯微圖像,直徑范圍為350-500微米。c. 排列好的球體的顯微圖像,直徑范圍為200-250微米。d. 排列好的球體的大小分布的圖示。測量是通過使用默認(rèn)的分割工具從顯微圖像中進(jìn)行的。(比例尺 = 500微米)。
分離后的細(xì)胞活性
為了評估spheroONE®分離后類球體的活性,在分離后4小時進(jìn)行了活/死染色(圖5)。分離和分裝并未損害細(xì)胞聚集體的完整性及其活性(圖5)。總體而言,細(xì)胞存活率超過 97%(圖5b)
圖5
分離后球體的存活率。
a. 分離球體的顯微鏡圖像,用Hoechst和PI染色。
b. 分離球體在分配后4小時的存活率圖示。分析顯示分離后存活率超過98%。(比例尺 = 500 µm)
結(jié)論與未來的方向
研究結(jié)果表明,SpheroONE® 平臺能夠高精度地重復(fù)分離單個球體(每孔單個球體高達(dá) 92%),并根據(jù)用戶定義的特征(大小和形狀)對其進(jìn)行分揀。通過使用生存率測定驗證了分離后球體的完整性,證明了spheroONE®技術(shù)在分選和分離過程中沒有損壞這些細(xì)胞聚集體或其中的細(xì)胞。這些能力展示了該儀器成為推動建立標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)雜體外3D模型的潛在技術(shù)的可能性,這將極大地加速藥物發(fā)現(xiàn),并最終減少或取代一些動物實驗。