加味通竅活血湯對(duì)基底動(dòng)脈增寬小鼠的影響

文獻(xiàn)信息
河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病四區(qū)張道培教授團(tuán)隊(duì)的研究成果《Effect of Jiawei Tongqiao Huoxue decoction in basilar artery dolichoectasia mice through yes-associated protein/transcriptional co-activator with PDZ-binding motif pathway》（加味通竅活血湯下調(diào)YAP/TAZ信號(hào)通路抗基底動(dòng)脈延長(zhǎng)擴(kuò)張癥的作用及機(jī)制研究）在雜志《Journal of Ethnopharmacology》上發(fā)表。平生公司的桌面離體CT（VENUS）在論文中提供了重要的小鼠腦部血管三維圖像。

 該研究的通訊作者為張道培教授。

文獻(xiàn)背景
研究背景: 加味通竅活血湯是在清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中通竅活血湯的基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，由石菖蒲15g，赤芍12g，川芎12g，桃仁15g，紅棗15g，紅花12g，葛根12g，生姜12g，全蝎9g，麝香0.15g等藥物組成，具有活血化瘀通絡(luò)的作用。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究顯示，加味通竅活血湯不但能改善患者椎、基底動(dòng)脈的血流速度，而且還能改善血流量和管壁剪切力的血流參數(shù)，但其分子機(jī)制尚未闡明。

研究目的:本研究旨在建立BAD小鼠模型，探討JTHD（加味通竅活血湯）的作用機(jī)制。

材料與方法:造模后C57/BL6雌性小鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、阿托伐他汀鈣片組、JTHD低劑量組、JTHD高劑量組。經(jīng)過(guò)14天的建模，藥物干預(yù)療程2個(gè)月。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)對(duì)JTHD進(jìn)行分析。ELISA法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的變化血清中VEGF和脂蛋白a的含量。采用EVG染色觀察病理變化血管。TUNEL法檢測(cè)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡率(VSMCs)。采用Micro-CT和ImagePro Plus軟件觀察和計(jì)算彎曲指數(shù);小鼠基底動(dòng)脈血管的延長(zhǎng)指數(shù)、血管直徑增加百分比和彎曲度。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物模型建立、分組及給藥
造模參考了Day等人的方法，即通過(guò)小鼠小腦延髓池，用微量注射器緩慢刺入枕骨大孔，注射2.5μL含有25mu的彈性蛋白酶。14天內(nèi)，因造模導(dǎo)致的死亡有5只小鼠。14天后，隨機(jī)取5只造模小鼠，通過(guò)FlowTech MICROFIL血管造影劑進(jìn)行造影，然后用解剖顯微鏡匹配的MicroPublisher 5.0 RTV的照相機(jī)拍攝血管網(wǎng)圖像，并用校正的Q-Capture Pro 7軟件進(jìn)行捕獲圖像，視覺評(píng)估基底動(dòng)脈彎曲、擴(kuò)張情況，當(dāng)小鼠基底動(dòng)脈出現(xiàn)彎曲、延長(zhǎng)、擴(kuò)張時(shí)，表示造模成功。假手術(shù)組僅在小腦延髓池內(nèi)注射含有滅活后的彈性蛋白酶的磷酸鹽緩沖液2.5μL。

 造模后小鼠分為模型組、阿托伐他汀鈣片組、加味通竅活血湯低劑量組、加味通竅活血湯高劑量組（n=10）。其中，阿托伐他汀鈣片組給予2.6mg·Kg·d-1阿托伐他汀鈣片灌胃，加味通竅活血湯低、高劑量組分別給予含有3.4g生藥材·Kg·d-1和17g生藥材·Kg·d-1的加味通竅活血湯顆粒劑，假手術(shù)組和模型組給予等體積的純水。小鼠給加味通竅活血湯的劑量是基于臨床上60kg體重的人每天服原藥材計(jì)算。
 小鼠離體基底動(dòng)脈形態(tài)的微CT斷層掃描

采用FlowTech MICROFIL血管造影劑進(jìn)行造影，固定24h后，剝離腦組織。應(yīng)用VENUS（平生醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)：VNC-102）對(duì)小鼠離體腦組織進(jìn)行了測(cè)量和分析。參數(shù)為：分辨率14μm，電壓和電流分別是90kV和0.06mA。CT掃描后，用Avatar軟件重建小鼠離體腦組織的圖像。然后使用分割功能，定義CT值大于500的范圍為血管區(qū)域，CT值大于-200以上范圍為整個(gè)小鼠腦組織區(qū)域。對(duì)指定的血管區(qū)域進(jìn)行裁剪，擦除和該血管相連的其他血管區(qū)域，保留指定血管區(qū)域。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)基底動(dòng)脈血管顯微結(jié)構(gòu)的影響
與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的基底動(dòng)脈明顯迂曲、延長(zhǎng)和擴(kuò)張，（圖6，7），而假手術(shù)組未見明顯的變化（P＜0.01）。與模型組相比，加味通竅活血湯干預(yù)2個(gè)月后，能夠顯著抑制顱內(nèi)基底動(dòng)脈的迂曲、延長(zhǎng)和擴(kuò)張（圖6，7）（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 小鼠顱內(nèi)動(dòng)脈血管的代表性三維圖像（n=4）

注：A空白組；B模型組；C阿托伐他汀鈣片組；D加味通竅活血湯低劑量組；E加味通竅活血湯高劑量組；↑ 所指的為基底動(dòng)脈血管，其中（A）假手術(shù)組基底動(dòng)脈血管平直，無(wú)彎曲和擴(kuò)張；（B）模型組基底動(dòng)脈血管出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張、延長(zhǎng)和迂曲；（C）阿托伐他汀鈣片組基底動(dòng)脈血管擴(kuò)張、延長(zhǎng)和迂曲的程度明顯減輕；（D）加味通竅活血湯低劑量組基底動(dòng)脈血管出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張、延長(zhǎng)和迂曲的程度有所減輕；（E）加味通竅活血湯高劑量組基底動(dòng)脈血管擴(kuò)張、延長(zhǎng)和迂曲的程度顯著減輕。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論
綜上所述，研究通過(guò)小腦延髓池注射彈性蛋白酶的方法，構(gòu)建了BAD小鼠模型，并鑒定出加味通竅活血湯含有多種抗血管炎癥反應(yīng)和血管重塑的有效化合物成分。然后觀察加味通竅活血湯的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗基底動(dòng)脈血管延長(zhǎng)、迂曲、擴(kuò)張作用，其機(jī)制可能與下調(diào)YAP/TAZ信號(hào)通路，抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

使用設(shè)備

Micro CT（型號(hào)：VENUS）（平生醫(yī)療科技）
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）