Histopaque® 密度梯度介質(zhì)故障排除指南
我們的技術(shù)支持科學家基于實際解決客戶問題時觀察到的現(xiàn)象及總結(jié)的經(jīng)驗，編譯了以下關(guān)于在細胞分離技術(shù)中使用 Histopaque 和 ACCUSPIN™ 的故障排除建議。本指南針對使用 Histopaque 時觀察到的最常見錯誤來源提出解決方案，但這并不代表本指南是全面無遺的。
使用 Histopaque/ACCUSPIN 時觀察到的典型問題- 從人體血液中分離單核或多形核細胞的困難
- 從大鼠或小鼠血液中分離單核或多形核細胞的困難
- 低恢復
- 分離細胞中的紅細胞、血小板或中性粒細胞污染
| 原因 | 溶液 |
|---|---|
| 分離前 >24 小時抽血 | 分離前 2-6 小時抽血。抽血 >24 小時將更難分離，回收率和存活率將更低。 |
| 由于沒有抗凝劑，血液已凝固 | 建議使用帶預(yù)裝抗凝劑的真空管。不建議使用注射器（不含抗凝劑）。 |
| 由于混合不完全，血液已經(jīng)凝固 | 確保抽完血后真空管與抗凝劑充分混合。 |
| 使用的抗凝劑不適用于 Histopaque 分離應(yīng)用 | 以下抗凝劑適用于 Histopaque： • 每毫升全血含有 15-30 單位肝素 • 每毫升全血中含有 1.25-1.75 mg EDTA ACA-A（酸性檸檬酸葡萄糖配方 A）可用作抗凝劑.分離后，產(chǎn)生的單核細胞帶將比其他抗凝劑更寬。這是正常的，細胞可以使用。 |
| 抽血后血液樣本溫度過高，分離嘗試太快 | 紅細胞污染可能是因為血液不在室溫下而產(chǎn)生的。 抽血后，應(yīng)讓血液在室溫下至少冷卻 30-45 min。如果在取材后立即使用，采集的單個核細胞數(shù)量會很低。當血液和 Histopaque 都在 18-20°C 時，分離程序是最佳的，可接受的溫度范圍為 18-26°C。 |
| 用高鹽濃度 PBS 稀釋血樣 | 與 Histopaque 一起使用的歷史細胞分離技術(shù)包括用 PBS (1：1) 稀釋血液。隨后，我們發(fā)現(xiàn)并非所有 PBS 制劑都適合與 Histopaque 一起使用。 含有 150 mm 磷酸鹽緩沖液和 150 mm 氯化鈉的溶液是鹽濃度太高而不能與 Histopaque 一起使用的 PBS 溶液.接近 10 mm 磷酸鹽的 PBS 摩爾濃度更適合與 Histopaque 一起使用。當用合適的細胞培養(yǎng)基代替高鹽濃度的 PBS 時，細胞活力將保持較高水平。 |
| 供體血液生理學的差異（當單個樣本的恢復較差時） | 高血脂、類風濕因子、貧血和藥物治療都可能是導致特定供者血液分離不良的原因。 如果血漿不清澈，則表明血脂水平過高. |
| 小動物樣品被其他液體或固體污染 | 由于在采集的血液中存在毛發(fā)和其他體液，因此從非針方式采血（例如通過尾部取樣）獲得的血液通常不可用。這通常引發(fā)凝血級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生凝血。 建議處死動物，通過主動脈或腔靜脈或其他大血管獲取血液。或者，可以使用兒科真空管抽血。 |
| 高水平白細胞樣本中白細胞的閉塞 | 當紅細胞與多聚蔗糖接觸時可形成聚集體，導致白細胞閉塞。一旦被困在這些聚集體中，白細胞就會移動到離心管的底部。 對于常規(guī)血液標本，未稀釋血液的回收率通常會更高。但應(yīng)稀釋骨髓、臍帶血和白細胞計數(shù)異常增高的供者樣本，以縮小紅細胞聚集體的體積，提高白細胞的回收率。 |
| 血液稀釋不當或用污染的 PBS 或培養(yǎng)基稀釋 | 在 Histopaque® 上樣前稀釋血液時，緩沖液或培養(yǎng)基配方有可能與 Histopaque 不相容，或者 PBS 或細胞培養(yǎng)基被污染。 如果血液已經(jīng)被稀釋且收率很差，則重復實驗，不進行樣品稀釋。 |
| 使用含有 FBS 或其他載體蛋白的細胞培養(yǎng)基進行稀釋 | 當稀釋樣品用于 Histopaque 時，不含 FBS 的細胞培養(yǎng)基可替代 PBS。如果用含有 FBS 的細胞培養(yǎng)基稀釋血液，回收的細胞數(shù)會更低。 在分離細胞并至少洗滌一次以除去 Histopaque 后，可將 FBS 加入到培養(yǎng)基中用于隨后的洗滌或儲存。第一次洗滌后，在洗滌介質(zhì)中加入 FBS 等蛋白質(zhì)，將進一步保護細胞免受損傷。 |
| 用 Histopaque 從白膜層中分離細胞 | 在合適的抗凝劑中收集血液并離心制備白膜層。紅細胞會沉淀到試管的底部。緊靠紅細胞層上方將是一個灰色層。這個灰色層是白膜層，代表了血液中所有的白細胞。在灰色層上面的是血漿。 用新鮮血液制備的白膜層適合使用 Histopaque 進行分離。如果細胞是幾天齡的，例如，如果白膜層是從捐獻的血液單位獲得的，細胞可能無法提供可接受的收率。 在加載到 Histopaque 梯度之前，必須將白膜層至少稀釋 1:2 或 1:4。 |
| 使用 ACCUSPIN™ 試管從白膜層分離細胞 | 白膜層制劑不能用于 ACCUSPIN 管。ACCUSPIN 試管需要一定數(shù)量的紅細胞才能正常工作，而白膜層缺乏足夠用于 ACCUSPIN 試管的紅細胞。 |
Histopaque/ACCUSPIN 故障排除提示
| 原因 | 溶液 |
|---|---|
| Histopaque的細菌污染 | Histopaque 是作為無菌溶液制造的。沒有防腐劑，以減少污染的機會。如果懷疑有污染，請使用新鮮的 Histopaque 瓶。 |
| Histopaque 溫度太低 | 如果使用冷的 Histopaque 或填充的 ACCUSPIN 試管，收率通常很低，并可觀察到細胞結(jié)塊。紅細胞污染也可能是因為 Histopaque 不在室溫下產(chǎn)生的。 執(zhí)行規(guī)程時溫度非常重要。在 2-8°C 條件下儲存的 100 mL 或 500 mL 瓶裝 Histopaque 可能需要幾個小時才能達到 18-20°C。在計劃使用 Histopaque 時，我們建議前一天從冰箱中取出 Histopaque，將瓶子放在長凳上靜置過夜。這可確保溶液處于室溫并可供使用。 也可選擇將適量的 Histopaque 轉(zhuǎn)移到每個離心機或 ACCUSPIN 管中，取較小體積適應(yīng)室溫。 收集細胞帶并進行第一次洗滌后，可在 4 °C 下進行余下的洗滌步驟。 |
技術(shù)故障排除提示
| 原因 | 溶液 |
|---|---|
| 在 Histopaque 上分層血液后延遲處理樣品 | 當將血液分層到用于單核細胞的梯度上時，不需要精確分層。如果在血液和 Histopaque 之間發(fā)生一點混合，細胞帶仍然會正常形成。 一旦血液分層，務(wù)必立即將離心管放入離心機。如果時間太長，整層的 Histopaque 會被紅血球染成紅色。在一定的“形成液滴”的數(shù)量下，這可能會降低單核細胞的回收率。應(yīng)限制一次處理的試管數(shù)量，以減少這種細胞擴散。 |
| 分離中性粒細胞時 Histopaque® 1077 和 Histopaque 1119 的分層不當 | 當同時使用 Histopaque 1077 和 Histopaque 1119 分離中性粒細胞時，必須謹慎操作來防止溶液界面的混合。 使用紋技術(shù)檢查界面的完整性。拿著試管對光觀察時，任何兩層之間界面處的旋渦或混合都應(yīng)該是明顯的。如果界面處理得當，應(yīng)該有一條清晰的分界線。 如果無清晰的分界線或界面處存在渦流，則丟棄管子重做。 梯度形成后立即使用也很重要。1077 和 1119 之間沒有化學差異；這兩種解決方案具有相同的組分，并將隨著時間開始一起擴散。當這種情況發(fā)生時，恢復將很差或根本不存在。 |
| 使用的粉末對有粉手套的污染。 | 不應(yīng)使用有粉手套。手套粉末會導致細胞聚集。僅限使用無粉手套。 |
| 使用的離心力不正確 | 應(yīng)檢查離心機以確保正確校準。過強的力（較高的離心速度）會降低收率。 |
| 使用前將 Histopaque 高壓滅菌 | Histopaque 不能通過高壓法滅菌；高壓滅菌會使溶液中的多聚蔗糖焦糖化，使其變成棕色�？赏ㄟ^ 0.22 微米過濾器無菌過濾 Histopaque。 |
| 分離后細胞內(nèi)的血小板或中性粒細胞污染 | 血小板污染或中性粒細胞污染一般是因為采集細胞帶時采集過多血漿或 Histopaque 1077 或 1083 而產(chǎn)生的。減少收集血漿或 Histopaque 的量。 |
| 用于清洗細胞聚合體的容量過大 | 洗滌細胞聚合體通常會去除血小板。如果在細胞聚合體上留下大量的洗滌液，將導致細胞懸液中血小板增多。 在不干擾細胞聚合體的情況下，盡可能多地去除洗滌介質(zhì)。血小板在 1000× g 的離心力下作用 10 min 通常不會聚合。在建議的洗滌步驟的較低離心速度下，血小板應(yīng)保持懸浮在洗滌介質(zhì)或上清液中。 |
| 細胞聚合體不形成單細胞懸液 | 重新懸浮細胞聚合體時，只需使用少量洗滌液。在 15 mL 或 50 mL 離心管中進行操作時，我們建議洗滌介質(zhì)不超過 0.5 mL。在顆粒上輕輕沖洗這種洗滌介質(zhì)。 可能需要將細胞懸液抽入吸管并分裝數(shù)次.一旦細胞處于單細胞懸液中，可以加入剩余的洗滌液并將溶液離心。 |
| 由于與離心管壁粘附而導致洗滌過程中細胞的損失 | 細胞偶爾會粘在離心管的壁上。如果細胞確實粘附在聚苯乙烯管上，管子就會顯得渾濁。 換用另一批聚苯乙烯離心管或改用另一種塑料，如聚乙烯。聚苯乙烯管中發(fā)生這種問題的情況最多，但其他類型的塑料也有報道出現(xiàn)細胞粘附的問題。 |
材料
| 產(chǎn)品名稱 | 包裝規(guī)格 |
|---|---|
| Histopaque®-1077 | 100ML |
| 6x100ML | |
| 500ML | |
| Histopaque®-1083 | 100ML |
| 6x100ML | |
| Histopaque®-1119 | 100ML |
| 6x100ML | |
| Histopaque-1077,Histopaque-1119 | 100+100ML |
| Histopaque®-1077 Hybri-Max™ | 100ML |
| 500ML |
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