cytiva細胞分離液（Ficoll-Paque 和 Percoll ）常見問題

高質(zhì)量密度梯度分離液。包括 Ficoll-Paque 和 Percoll 產(chǎn)品

Percoll

• PERCOLL 是無菌的嗎？
  Percoll/Percoll PLUS 在生產(chǎn)過程中是經(jīng)過高溫滅菌處理的，但是由于瓶子的材質(zhì)問題，只能在 113℃ 條件下進行，持續(xù)時間為 1 h。目前在官方說明書中不再申明 Percoll/Percoll PLUS 為無菌的。如果對滅菌要求較高，可以進一步滅菌，條件是 120℃，30 min，但需要從原包裝瓶中轉(zhuǎn)移出來。Percoll 溶液的高壓滅菌必須在沒有鹽和蔗糖時進行（建議只對原液滅菌）。
• PERCOLL 的配制方法有哪些？
  Percoll 的配制一般有兩種方法：
  1. 按照百分比用兩步法計算：用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液，得到 100% 的 SIP 溶液。在此基礎(chǔ)上，比如想要得到 44% 和 67% 的工作液，分別按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖：SIP=（100-44）：44 和（100-67）：67 的比例取相應(yīng)體積的溶液進行配制即可。
  2. 根據(jù)密度進行一步法計算，該計算方法需要知道最終配制的溶液的密度、細胞分離液的密度（Percoll 密度范圍 1.130.005 g/ml，具體密度可根據(jù)批次號在英文官網(wǎng)中查詢 COA 獲得），以及用于稀釋的 buffer 的密度（1.5M 的 NaCl 密度為 1.058 g/ml，2.5M 的蔗糖的濃度為 1.316 g/ml），推薦官網(wǎng)的計算小程序，鏈接如下：
     https://www.cytivalifesciences.com.cn/zh/cn/support/online-tools/cell-preparation/Percoll-calculator
• PERCOLL 目前可用于哪些種屬和細胞類型？
  Percoll 的應(yīng)用領(lǐng)域很廣，涉及多個物種多種細胞類型，還可以分離亞細胞結(jié)構(gòu)，有廣泛的文獻支持。當客戶詢問能否做某些應(yīng)用時，可對照下圖查詢是否可以應(yīng)用。

• PERCOLL的保存條件是什么？
  Percoll 在沒有被打開時，在室溫下可以保存 5 年，打開后應(yīng)該保存在 4℃-8℃，盡快用完。Percoll 可以冷凍保存在-18°C 中 6 個月，如果保存在-18°C，在融化時會形成梯度，在使用前必須混合瓶中的內(nèi)含物。
• 用 PERCOLL 分離人不同類型的細胞，是否有可以參考的密度范圍？
  目前有如下所示細胞類型和浮力密度供參考：

• 用兩步法將 PERCOLL 母液配成 25%，32%，47% 等濃度具體操作如何？
  1. 制備 SIP：對于普通的細胞，將 9 份 Percoll 加入到 1 份 1.5M NaCl 或 1 份 10×濃縮培養(yǎng)基中，通過加鹽或者蒸餾水可以最終調(diào)節(jié)到所需要的滲透壓；對于有鹽存在時會發(fā)生聚集的亞細胞顆粒，可以通過添加 9 份 Percoll 到 1 份 2.5M 的蔗糖中來制備 SIP（制成的 SIP 可以理解為 100% 的 Percoll，也有文獻中將 SIP 理解為 90% 的 Percoll，具體看文獻中的做法）
  2. 稀釋到終濃度：對于細胞，可以添加 0.15M 的 NaCl，對于亞細胞顆�；虿《緞t添加 0.25M 的蔗糖。最終按照比例進行稀釋，得到不同百分比的分離液。

Ficoll

• FICOLL 分離人外周血單個核細胞 PBMC的原理是什么？具體實驗操作時常見問題及原因分別如何？
  根據(jù)細胞密度的不同進行分離。單個核細胞的體積、形狀和比重與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞比重較大，為 1.092 左右，淋巴細胞和單個核細胞比重為 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集：血漿和血小板密度較低,，懸浮于分離液的上部；紅細胞與粒細胞密度較大，沉于分離液的底部；PBMC 密度稍低于分離液，位于分離液界面之上，移去上層組分就可獲得 PBMC。
• FICOLL 可用于哪些種屬細胞的分離？
  Ficoll 被用作從外周血、骨髓及臍帶血中分離高活性的單個核細胞（包括淋巴細胞和單核細胞）
  1. Ficoll-Paque PLUS 主要用于人外周血中淋巴細胞的分離，如果待分離的淋巴細胞來自其他的組織/種屬，可能無法獲得淋巴細胞的最佳產(chǎn)量和純度，需要對標準操作進行優(yōu)化。
  2. 已有在鼠、狗、猴、牛、兔、馬、豬甚至魚淋巴細胞分離上的應(yīng)用，具體操作條件可以查詢對應(yīng)文獻（在 Ficoll 操作手冊上提供了文獻）。
  3. 不滿足條件的種屬或來源，可以先用 Ficoll 分離出單個核細胞，再加一步 Percoll 來實現(xiàn)最終的分離目的。
• FICOLL是無菌的嗎？
  Ficoll 已經(jīng)在 121℃、20 min 進行了滅菌，為無菌狀態(tài)，建議無菌操作，分次取用即可。再次滅菌的話由于客戶的滅菌設(shè)備等的差異，沒有推薦的滅菌條件。另外如果滅菌時沒有保證蓋子的密封性和穩(wěn)定的溫度，可能會造成 pH 波動。
• FICOLL 的保存條件是什么？
  Ficoll應(yīng)避光儲存于 4-30 °C 之間，在該條件下可以保存 3 年。打開后建議存儲于 4-8℃。偶爾短時冷凍，解凍后來回反復倒置，確保溶液的均一。
• 用 FICOLL-PAQUE PLUS 分離 T 淋巴細胞，可否用塑料管？
  分離時一般都用塑料管，長期儲存因為需要避光，不適合用來儲存。Ficoll 有泛影酸鈉，需要避光�？梢杂盟芰掀�+錫箔紙短期儲存（兩周）。
• 用 FICOLL 進行人外周血中淋巴細胞的分離時，淋巴細胞所處的位置如何，各層分別是哪種細胞？
  離心完成后，從管底往上依次為紅細胞-粒細胞-Ficoll 細胞分離液-淋巴細胞-血小板-血漿。在取淋巴細胞時要小心將上層的血漿和血小板移除后再吸取淋巴細胞。

• 用 FICOLL 進行人外周血中淋巴細胞的分離時，血液樣品和 FICOLL 的比例是如何的？大體積樣品該如何處理？
  1. 按照樣品：Ficoll 的高度比約為 3:2.4 或體積比 4:3 的比例進行樣品和分離液的添加。
  2. 大體積樣品可以通過增加離心管的直徑來進行分離。增加離心管直徑并不影響所需的分離時間。