靶向脂肪的Adipoq-iCre小鼠的介紹及工具鼠熒光檢測(cè)解決方案

熒光檢測(cè)是工具鼠研究中的重要手段，不僅能評(píng)估重組效率還能進(jìn)行基因表達(dá)譜可視化分析和遺傳譜系示蹤。然而，有時(shí)會(huì)遇到熒光信號(hào)無(wú)法被檢測(cè)的困擾，應(yīng)該怎么辦呢？

在飲食、生活方式等因素的多重作用下，“減肥”和“降脂”話(huà)題的熱度不斷攀升。研究脂肪不僅是關(guān)乎體態(tài)，而且還與代謝類(lèi)疾病等健康問(wèn)題密切相關(guān)。今天，小賽要為大家介紹的是一款特異性靶向脂肪細(xì)胞的“定位系統(tǒng)”——Adipoq-iCre小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：C001529）。

Adipoq-iCre小鼠
ADIPOQ基因編碼的脂聯(lián)素是一種蛋白質(zhì)激素，僅由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，并通過(guò)血液傳輸?shù)郊∪夂透渭?xì)胞。脂聯(lián)素調(diào)節(jié)與脂肪儲(chǔ)存和代謝相關(guān)的多種途徑，包括調(diào)節(jié)血糖水平、脂肪酸分解、棕色脂肪細(xì)胞分化和糖異生的負(fù)調(diào)控等。

賽業(yè)生物利用基因編輯技術(shù)自主研發(fā)構(gòu)建了Adipoq-iCre小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：C001529），該模型在小鼠Adipoq基因調(diào)控元件的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)密碼子優(yōu)化后的Cre重組酶（iCre）。iCre重組酶的表達(dá)模式與內(nèi)源基因相似，且內(nèi)源性Adipoq基因表達(dá)不受影響。當(dāng)Adipoq-iCre小鼠與含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的小鼠進(jìn)行雜交時(shí)，其子代小鼠的白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中可以發(fā)生由Cre重組酶介導(dǎo)的loxP位點(diǎn)間的序列重組。

白色脂肪和棕色脂肪中的Cre重組活性

圖1 白色脂肪和棕色脂肪中tdTomato蛋白表達(dá)的免疫熒光（IF）檢測(cè)

將Adipoq-iCre小鼠與條件性表達(dá)tdTomato熒光蛋白的Rosa26-LSL-tdTomato小鼠交配，取子代的白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）進(jìn)行免疫熒光（IF）檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示在Cre+小鼠的脂肪組織中存在大量的tdTomato紅色熒光信號(hào)。

其他組織中的Cre表達(dá)情況

圖2 骨骼肌、皮膚、肺部、心臟、睪丸和卵巢中tdTomato蛋白表達(dá)的免疫熒光（IF）檢測(cè)

結(jié)果顯示，在Cre+小鼠的骨骼肌、皮膚、肺、支氣管中檢測(cè)到部分紅色熒光，同時(shí)在小鼠的心臟、卵巢周?chē)�脂肪、卵巢間質(zhì)和黃體中存在極少量的熒光信號(hào)，而在睪丸中未觀察到熒光信號(hào)。

總  結(jié)
在Adipoq-iCre小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：C001529）中，Cre重組酶的表達(dá)主要集中于白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中，組織表達(dá)特異性良好。此外，在小鼠骨骼肌、皮膚、肺部和心臟中存在部分重組信號(hào)，根據(jù)組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)分析推測(cè)該類(lèi)細(xì)胞可能是脂肪細(xì)胞。因此，該模型可用于靶向脂肪的組織特異性研究。

問(wèn)：熒光檢測(cè)是工具鼠研究中的重要手段，不僅能評(píng)估重組效率還能進(jìn)行基因表達(dá)譜可視化分析和遺傳譜系示蹤。然而，有時(shí)會(huì)遇到熒光信號(hào)無(wú)法被檢測(cè)的困擾，應(yīng)該怎么辦呢？

答：我們有時(shí)會(huì)遇到熒光信號(hào)無(wú)法被檢測(cè)的困擾，以下提供一些原因分析及解決方案：
1. 熒光信號(hào)直接被破壞
(1) 熒光淬滅
在冰凍切片過(guò)程中，熒光信號(hào)容易被淬滅。直接使用熒光顯微鏡觀察時(shí)，務(wù)必避光操作，或改用免疫熒光或免疫組化。此外，還可以與其他熒光報(bào)告鼠配繁來(lái)放大熒光信號(hào)以便觀察。

(2) 樣品處理不當(dāng)
樣品固定、封閉或染色步驟處理不當(dāng)可能導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱甚至丟失。

2. 基因表達(dá)的連鎖影響
(1) 重組酶表達(dá)水平低
Cre重組酶表達(dá)水平低或活性不足會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)基因flox位點(diǎn)重組效率低，進(jìn)而無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)。例如，CMV-Cre小鼠的Cre基因打靶在X染色體上，X染色體的隨機(jī)失活可能導(dǎo)致基因組鑒定為Cre陽(yáng)性，但Cre蛋白卻未表達(dá)。此外，CMV啟動(dòng)子還易受表觀遺傳修飾沉默，也會(huì)導(dǎo)致重組現(xiàn)象不發(fā)生。

(2) 誘導(dǎo)條件不充分
例如他莫昔芬誘導(dǎo)Cre入核表達(dá)時(shí)，使用了不正確的誘導(dǎo)劑量及周期會(huì)影響Cre表達(dá)，進(jìn)而影響報(bào)告鼠Rosa26-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato的熒光表達(dá)。因此，在正式實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳誘導(dǎo)條件，或嘗試更高效的Cre表達(dá)系統(tǒng)。

(3) 模型設(shè)計(jì)的影響
例如在構(gòu)建熒光工具鼠時(shí)，熒光是通過(guò)IRES元件連接在下游位置。由于IRES元件本身的特點(diǎn)，連接前后的基因雖然是共表達(dá)，但是位于IRES元件后的表達(dá)量是較低的，因此熒光強(qiáng)度受到影響。如果再加上使用的是弱啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，那熒光檢測(cè)將更加困難。

3. 實(shí)驗(yàn)操作中被忽視的細(xì)節(jié)
(1) 減少背景熒光干擾
由于觀測(cè)位置和深度不同，激發(fā)光和發(fā)射光容易被組織吸收，導(dǎo)致高背景和低信噪比，檢測(cè)靈敏度受限。需要對(duì)檢測(cè)組織進(jìn)行除毛處理，或使用自發(fā)熒光淬滅劑處理樣品，選擇避開(kāi)自發(fā)熒光峰值波長(zhǎng)的熒光蛋白或染料。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，以便快速排除失敗原因。

(2) 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)材料
檢查并確認(rèn)熒光抗體、熒光染料等的質(zhì)量和適用性。

(3) 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)參數(shù)
選擇合適的波長(zhǎng)，例如tdTomato的激發(fā)波長(zhǎng)為554nm，發(fā)射波長(zhǎng)為581nm。

(4) 確認(rèn)基因型
在實(shí)驗(yàn)前使用PCR檢測(cè)樣本的基因型是非常必要的，再使用qPCR或WB等(因樣本而異）檢測(cè)特異性組織的表達(dá)情況。