多肽分離的實(shí)用方法及工作流程注意事項(xiàng)的介紹

粗制肽分析完成之后的步驟是將方法幾何放大至具有相同填料的大規(guī)格色譜柱上用于分離。圖2中的放大公式展示了在不同規(guī)格色譜柱之間轉(zhuǎn)換分離方法時(shí)，色譜柱直徑、柱長(zhǎng)、載樣量和流速之間的關(guān)系。梯度斜率表示為單位柱體積對(duì)應(yīng)的溶劑變化百分比，而非單位時(shí)間內(nèi)溶劑變化的百分比，可確保梯度方法從初始條件到最終條件的各個(gè)步驟輸送的柱體積數(shù)量始終相同，從而保持分離度一致。制備級(jí)方法必須包括一段用于模擬系統(tǒng)延遲的起始條件保持時(shí)間，具體將通過小規(guī)模分離確定，同樣以柱體積數(shù)量表示。制備型色譜分離完成后，將對(duì)收集到的餾分進(jìn)行分析評(píng)估。純肽的后續(xù)處理應(yīng)遵循用戶指南。
 

肽分離完全可以采用配備泵、進(jìn)樣器、UV檢測(cè)器和餾分收集器的簡(jiǎn)單液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行（圖3）。雖然并不是肽分離必須采用的技術(shù)，但質(zhì)譜檢測(cè)可鑒定目標(biāo)肽并減少分離之后需要進(jìn)行分析的餾分?jǐn)?shù)量。無法電離或難電離的化合物通常采用短波長(zhǎng)UV檢測(cè)。相反，UV吸光性極差的肽通�？捎蒑S輕松檢出。
 

純化過程注意事項(xiàng)
分離模式
由于不同肽的特性各異，分離可用的色譜模式也有許多選擇。盡管反相色譜是目前應(yīng)用最廣的肽分離模式，但使用離子交換色譜或體積排阻色譜等替代選擇方法來分離某些肽會(huì)更加高效。這些替代技術(shù)也可與反相色譜聯(lián)用，制定專用于棘手樣品的兩步分離方案。

反相色譜
反相色譜因其重現(xiàn)性好、適用性廣的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于多種類型化合物的分離，其中也包括肽的分離。非極性的C18-鍵合硅膠是相當(dāng)常用的一類反相色譜柱填料。反相色譜流動(dòng)相通常由水和可與水混溶的極性有機(jī)溶劑（例如乙腈或甲醇）組成，這種流動(dòng)相會(huì)根據(jù)化合物極性從C18色譜柱上洗脫化合物。因此，肽本身的疏水性越強(qiáng)，它在C18色譜柱上的保留性就越好。

雖然C18是相當(dāng)常用的反相填料，但其他一些鍵合相（C4、C8、RP18、苯基等）也可與基質(zhì)顆粒鍵合，為優(yōu)化化合物分離提供替代選擇性。硅膠是最早問世的反相色譜柱填料之一，但硅膠基質(zhì)填料會(huì)限制分離速度、分離度、pH、溫度耐受性以及色譜柱載樣量。采用獲專利的*雜化顆粒技術(shù)開發(fā)的新型色譜柱基質(zhì)顆粒能夠在更高的流速、溫度和pH下運(yùn)行，同時(shí)提高選擇性、分離度、重現(xiàn)性并延長(zhǎng)色譜柱壽命。
*美國(guó)專利號(hào)6,686,035 B2

離子交換
離子交換色譜從很早開始就被用于蛋白質(zhì)及其他生物制劑的分離。由于組成肽的氨基酸帶有正電或負(fù)電，因此可采用離子交換色譜進(jìn)行肽分離。經(jīng)過官能化的天然聚合物樹脂（如瓊脂糖）和合成聚合物（如聚甲基丙烯酸甲酯(MMA)，或苯乙烯-二乙烯苯共聚物）是大分子分離的常用介質(zhì)，因?yàn)檫@些填料可承受大規(guī)模生物處理的工藝周期和批次之間極為嚴(yán)苛的清潔處理。上述工藝采用的氫氧化鈉溶液會(huì)損壞小分子和小規(guī)模肽分離常用的硅膠基質(zhì)填料。

離子交換劑可分為四種：弱陰離子交換劑、弱陽離子交換劑、強(qiáng)陰離子交換劑和強(qiáng)陽離子交換劑。陽離子交換模式用于保留并分離帶負(fù)電表面上的正電荷離子，而陰離子交換模式則用于保留并分離帶正電表面上的負(fù)電荷離子。強(qiáng)陰離子和強(qiáng)陽離子交換色譜柱可在較寬的pH范圍內(nèi)(2–12)完全離子化，而弱離子交換色譜柱只能在較窄的pH范圍內(nèi)(9.5–5.5)離子化。

相較于陰離子交換模式，陽離子交換模式更常用于肽分離，但具體選用哪種模式取決于肽序列。在pH小于3的條件下進(jìn)行肽分離時(shí)，氨基酸側(cè)鏈羧基上的負(fù)電將被中和，同時(shí)N-端基團(tuán)質(zhì)子化，使得肽帶上正電荷，進(jìn)而被吸引至陽離子交換色譜柱上的負(fù)電位點(diǎn)（圖4）。
 

反之，對(duì)于適合在pH 6-10的條件下進(jìn)行分離的肽，應(yīng)采用陰離子交換模式。在較高pH條件下進(jìn)行陰離子交換時(shí)，肽上的羧基帶負(fù)電，因此會(huì)被吸引至陰離子交換色譜柱上的正電位點(diǎn)（圖5）。
 

為應(yīng)用離子交換技術(shù)的肽分離方法選擇色譜柱和進(jìn)行方法開發(fā)時(shí)，應(yīng)遵循幾條一般建議。陰離子和陽離子交換模式均可使用，基本原則是：分離酸性肽采用陰離子交換模式，分離堿性肽采用陽離子交換模式。對(duì)于某些肽，可能需要反向運(yùn)用該原則（尤其是分子量較大的肽），但必須通過調(diào)節(jié)pH使肽所帶的凈電荷與填料所帶的電荷相反。

無論極性如何，強(qiáng)交換劑都是肽色譜分離的首選。肽的帶電情況是序列和帶電側(cè)鏈所處微環(huán)境共同作用的結(jié)果。針對(duì)具體的肽序列，可通過小幅調(diào)整流動(dòng)相pH來調(diào)節(jié)分離的選擇性。選擇性的小幅調(diào)整不會(huì)影響強(qiáng)離子交換劑的結(jié)合能力。

離子交換分離是作為兩步純化方案中的第一步還是作為單步分離方案用于制備實(shí)驗(yàn)材料，會(huì)影響流動(dòng)相和操作條件的選擇。如果離子交換分離的產(chǎn)物將通過反相色譜進(jìn)一步純化，則可以采用蛋白質(zhì)離子交換方案常用的緩沖液和洗脫條件，例如使用磷酸鹽或Tris緩沖液并采用氯化鈉梯度進(jìn)行洗脫。產(chǎn)物中的鹽將通過后續(xù)步驟去除。

如果要通過離子交換法一步得到可用的肽，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇可通過凍干去除的揮發(fā)性緩沖液。甲酸銨是理想選擇，因?yàn)樗�具有分別對(duì)應(yīng)銨鹽和甲酸鹽pK值的兩個(gè)緩沖區(qū)域。甲酸銨既可在pH 3-4的條件下用于堿性肽的陽離子交換色譜分離，又可在pH 9.25-10.25的條件下用于酸性肽的陰離子交換色譜分離。在pH恒定的條件下，可利用甲酸銨濃度逐漸升高的離子強(qiáng)度梯度來洗脫目標(biāo)肽。另一方面，利用pH梯度進(jìn)行洗脫則能夠省去通過凍干去除高離子強(qiáng)度緩沖液的耗時(shí)操作。同樣地，甲酸銨緩沖液是很好的起始緩沖液。采用陰離子交換劑分離酸性肽時(shí)的洗脫梯度為pH從高到低，采用陽離子交換劑分離堿性肽時(shí)的洗脫梯度則為pH從低到高。

體積排阻色譜
根據(jù)分子大小進(jìn)行色譜分離的技術(shù)如今被稱為體積排阻色譜(SEC)，該技術(shù)可追溯至20世紀(jì)50年代。這種分離技術(shù)基于分子大小進(jìn)行色譜分離，而非基于分子的帶電情況或極性等化學(xué)特性，過去也被稱作凝膠過濾或凝膠滲透色譜(GPC)。具有特定孔徑分布的固定相顆�？勺柚勾笥谥�床孔穴的樣品分子進(jìn)入，從而使其快速洗脫出來，小分子則會(huì)進(jìn)入孔穴中并深入更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，洗脫速度較慢。因此，大分子最先洗脫，小分子則根據(jù)其在溶液中的大小以降序順序洗脫出來（圖6）。SEC是一種低分離度技術(shù)，采用等度方法且運(yùn)行之間無需進(jìn)行平衡。色譜柱載樣量取決于樣品體積和濃度，而這兩個(gè)因素都會(huì)影響分離度。