PCR、qPCR和RT-PCR的特點、操作步驟及常見問題的原因

PCR 作為分子生物學的超級工具，有著多種變體。今天，我們就來深入聊聊各類 PCR 的區(qū)別及實驗操作步驟，讓你從此對 PCR 了如指掌！

01
各類 PCR ，分不清？

PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶鏈式反應，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母鏈 DNA 為模板，以特定引物為延伸起點，反應體系中加入 dNTP、Mg2+ 等原料，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板 DNA 互補的子鏈 DNA 的過程，可快速特異性地在體外擴增目的 DNA[1][2]。

知識鏈接

• Ct 值 (Cycle threshold，循環(huán)閾值)，是指 qPCR 反應中熒光信號達到設定閾值時對應的循環(huán)數(shù) (一般 Ct 值在 20-30 之間)。

• 擴增曲線 (Amplification curve) 是指隨 PCR 反應進行，根據(jù)熒光信號強度隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的曲線。正常的擴增曲線 (S 型) 包括四個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期。

• 熔解曲線 (Dissociation curve) 是指隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結構降解程度的曲線。

• 擴增子 (Amplicon) 為DNA或RNA擴增后的一段核苷酸序列。比如通過PCR擴增得到的某個基因的擴增片段。更簡單地說，擴增子是經(jīng)過人工擴增的DNA片段或RNA片段的擴增產物。

 
PCR 在基礎科學研究 (如基因功能分析、基因檢測)、醫(yī)學診斷 (如病原體檢測和遺傳病篩查)、法醫(yī)鑒定 (如身份鑒定) 以及環(huán)境監(jiān)測 (如生物多樣性研究) 等具有廣泛的應用，是現(xiàn)在生物技術和遺傳研究的核心工具。

 
當然，各類 PCR 實驗除了在特點、應用、優(yōu)缺等有諸多不同之外，其實驗操作也是有區(qū)別滴~接下來就和小 M 一起來看下它們的操作步驟吧！ 

02
常規(guī) PCR

PCR 的基本成分包括模板 DNA、引物、反應緩沖液、游離核苷酸、聚合酶、鹽和水 (不含核酸酶和污染 DNA) 等。只要目標區(qū)域兩側的堿基序列 (尋找的特定 DNA 序列)是已知的，幾乎任何 DNA 區(qū)域都可以作為 PCR 擴增的模板[10]。

在典型的 PCR 分析中，通過重復簡單的三步過程：變性、退火和延伸，目標區(qū)域即可完成擴增 (圖 1)。

圖 1. PCR 反應流程圖^[10]。

 
基本步驟：

(1) 準備反應體系：模板 DNA、引物 (正、反向)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反應緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強度)、耐高溫 Taq DNA 聚合酶、去離子水等。也可直接使用 PCR Mix。
(2) PCR 擴增：設置 PCR 擴增程序 (包含變性、退火、延伸、循環(huán)、徹底延伸)。
(3) 檢測：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

03
實時熒光定量 PCR (qPCR)

實時熒光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) 是 DNA 的實時 PCR 擴增，通過熒光探針測量，最常見的是插入染料或基于水解的探針，從而實現(xiàn) PCR 產物的定量 (見圖 2)。該技術常用于檢測病原體的存在和確定感興趣的 DNA 序列的拷貝數(shù)。

 
同樣要經(jīng)過多個擴增循環(huán)，其中模板 DNA 最初變性，然后是針對特定序列的寡核苷酸引物的退火，隨后通過耐熱 DNA 聚合酶從每個退火引物延伸互補鏈，導致擴增子數(shù)量在 PCR 期間呈指數(shù)增長，擴增子數(shù)量的增加是在 PCR 過程中通過熒光報告基因檢測“實時”記錄的。

基本步驟：

(1) 準備反應體系：模板 DNA 或經(jīng)過逆轉錄得到的 cDNA、引物 (正、反向)、熒光染料 (如 SYBR Green) 或探針 (如 Taq man 探針、qPCR 探針等)、dNTPs   (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反應緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強度)、耐高溫 Taq DNA 聚合酶或專用的熒光 PCR 聚合酶、去離子水等。也可直接使用 qPCR Kit。
(2) PCR 擴增：同常規(guī) PCR，并設置熒光檢測步驟。
(3) 熒光檢測：通過熒光探針或染料實時監(jiān)測熒光信號。
(4) 數(shù)據(jù)分析：根據(jù) Ct 值和標準曲線，計算樣本中的目標 DNA 或 RNA 濃度。

常用兩種報告系統(tǒng)：插入式 SYBR Green 測定法和 TaqMan 探針系統(tǒng)。

01
SYBR Green 

• SYBR Green 通過插入相鄰堿基對與所有雙鏈 DNA 結合，發(fā)出熒光信號 (圖 3A)。

• 在未結合狀態(tài)下，SYBR Green 不發(fā)出熒光。因此，在每個周期中，通過熒光的相應增加來測量模板擴增。

02
TaqMans 探針

• 退火過程中，Taq Man 探針和引物與模板結合。當 Taq Man 探針完好無損時，能量在猝滅器和報告器之間傳遞，因此，沒有檢測到熒光信號。

• 當 Taq 聚合酶合成新鏈時，該酶的 5’ 外切酶活性會切割帶有標記的探針上的 5’ 核苷酸，從而使報告分子從探針上釋放出來。一旦它不再靠近，來自探針的熒光信號被檢測到，并通過熒光的相應增加記錄模板擴增 (圖 3B)。

 
04
逆轉錄 PCR (RT-PCR)

逆轉錄 PCR (Reverse transcription PCR, RT-PCR) 可使用 RNA 作為模板生成互補 DNA (cDNA)。利用逆轉錄酶，產生 cDNA 的單鏈拷貝。然后，這可以通過 DNA 聚合酶擴增，產生雙鏈 cDNA，進入基于 PCR 的標準擴增過程 (圖 4A)。

該技術可用于目標基因 (GOIs) 的分子克隆，其可研究用抑制劑、興奮劑、小干擾 RNA (siRNA) 或敲除模型等處理模型系統(tǒng)后基因表達的變化。這項技術也經(jīng)常用于檢測 RNA-Seq 實驗之前 (作為質量控制) 和之后 (確認變化) 的表達變化。

基本步驟：

(1) 準備反應體系：提取 RNA，加入逆轉錄酶 (常用的逆轉錄酶有 M-MLV 逆轉錄酶和 AMV 逆轉錄酶)、引物 (通常使用隨機引物，oligo (dT) 引物或基因特異性引物)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、反轉錄緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強度)、RNase 抑制劑 (防止 RNA 在反應過程中降解)、去離子水等。也可直接使用 RT-PCR Kit。
(2) 逆轉錄：設置逆轉錄程序。
(3) PCR 擴增：以合成的 cDNA 為模板進行 PCR 或 qPCR 實驗。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和兩步法 RT-qPCR 兩種)。
(4) 產物分析：通過瓊脂糖凝膠電泳 (RT-PCR) 或熒光信號 (RT-qPCR) 分析擴增效果。

此外，一種將 RT-PCR 與 qPCR 相結合的技術，逆轉錄定量實時 PCR (Reverse transcription  quantitative real-time PCR, RT-qPCR)。通過在 qPCR 反應中使用 cDNA 來測量 RNA 水平，從而可以快速檢測基因表達變化 (圖 4B)。

圖 4. RT-PCR 和 RT-qPCR 流程圖^[11]。

注：RNA 質量至關重要�。�！OD_260/280=1.9-2.1 的 RNA 才 "優(yōu)秀" 。

此外，選擇合適的內參 (或內標) 是非常重要的，這關系到實驗結果的準確性和可靠性。小 M 為大家整理了qPCR 常用的內參基因參考，需要的小伙伴可關注收藏喔~ 
 

 
選擇策略 Tips：根據(jù)實驗樣本類型進行預實驗測試候選內參基因在目標樣本中表達的穩(wěn)定性確定合適的內參基因。

05
數(shù)字 PCR (dPCR)

數(shù)字 PCR (Digital PCR, dPCR) 是目前可用的另一種強大技術，在臨床診斷中有著廣泛的應用。其中，dPCR 方法用于液體活檢中的癌癥監(jiān)測和器官移植排斥監(jiān)測等應用，這兩種方法都基于檢測患者樣本中低豐度的無細胞 DNA[13]。

dPCR 技術的原理 (圖 5) 涉及將具有制備的 PCR 溶液的樣本分離成大量分區(qū) (通常為納升大小的液滴)，其中單獨進行 PCR 反應。每個分區(qū)包含零個、一個或幾個目標 DNA 副本，遵循泊松分布 (Poisson distribution)。

在熒光探針存在下進行等位基因特異性 PCR 反應后，通過熒光檢測含有擴增目標序列的分區(qū)。每個分區(qū)單獨進行熒光掃描，根據(jù)目標 DNA 的副本是否存在，讀數(shù)為“1”或“0”。陽性分區(qū)占總數(shù)的比例可以確定樣本中目標序列的濃度。

基本步驟：

(1) 樣本準備：模板 DNA 或通過逆轉錄反應得到的 cDNA，調整至合適濃度用于后續(xù)分配過程。
(2) 反應體系準備：模板 DNA 或 cDNA、引物 (正、反向)、熒光染料 (常用 SYBR Green) 或探針 (如 Taqman 探針、qPCR 探針等)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反應緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強度)、耐高溫 Taq DNA 聚合酶或專用的數(shù)字 PCR 聚合酶、去離子水等。
(3) 反應體系分配：將反應混合液分為多個微反應單元。
(4) PCR 擴增：設置 PCR 擴增程序，每個微反應單元獨立進行 PCR 擴增反應 (包含變性、退火、延伸、循環(huán)、徹底延伸)。
(5) 數(shù)據(jù)分析：檢測陽性反應單元數(shù)量并定量分析樣本中目標 DNA 或 RNA 的濃度。
 
注意事項：

• 設置合適的陰性對照和陽性對照可確保實驗結果的可靠性。
• 數(shù)字 PCR 一般需要比常規(guī) PCR 更多的循環(huán)次數(shù)，因為在有的微反應單元中的模板可能經(jīng)過幾次循環(huán)之后才開始擴增反應。高次數(shù)循環(huán)反應能保證只要孔中有模板，每個 PCR 孔中都能產生幾乎相等的 PCR 產物。 

06
小結

PCR 技術是分子生物學研究的利器，了解掌握各類 PCR 的特點、操作步驟及常見問題的原因，有助于提高實驗成功率，為科研提供可靠數(shù)據(jù)支持。希望這篇整理對你有所幫助！如果有更多問題或經(jīng)驗分享，歡迎在評論區(qū)留言，我們一起探討學習！ 

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Catalog No.	Drug Name
HY-K0531	2× PCR Master Mix (with Dye)
HY-K0501	SYBR Green qPCR Master Mix
HY-K0501A	SYBR Green qPCR Master Mix (Universal)
HY-K0511A	RT Master Mix for qPCR Ⅱ (gDNA digester plus)
HY-K0510A	RT Master Mix for qPCR Ⅱ
HY-K0512	RT Master Mix for qPCR Ⅲ (poly A)

參考文獻：
[1] Mullis KB, et al. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50.
[2] Saiki RK, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. 
[3] Garcia JG, et al. Polymerase chain reaction: a landmark in the history of gene technology. Crit Care Med. 2005 Dec;33(12 Suppl):S429-32.
[4] Taylor SC, et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019 Jul;37(7):761-774.
[5] Bustin S, et al. Talking the talk, but not walking the walk: RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecular research. Eur J Clin Invest. 2017 Oct;47(10):756-774.
[6] Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000 Oct;25(2):169-93.
[7] Sanders R, et al. Improving the standardization of mRNA measurement by RT-qPCR. Biomol Detect Quantif. 2018 Mar 16;15:13-17.
[8] Coudray-Meunier C, et al. A comparative study of digital RT-PCR and RT-qPCR for quantification of Hepatitis A virus and Norovirus in lettuce and water samples. Int J Food Microbiol. 2015 May 18;201:17-26.
[9] Fraisse A, et al. Digital RT-PCR method for hepatitis A virus and norovirus quantification in soft berries. Int J Food Microbiol. 2017 Feb 21;243:36-45.
[10] Analytical Methods, et al. PCR - the polymerase chain reaction. Anal Methods. 2013 Dec 19;6(2):333-336.
[11] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.
[12] Smith CJ, et al. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 2009 Jan;67(1):6-20.
[13] Nogués N. Recent advances in non-invasive fetal HPA-1a typing. Transfus Apher Sci. 2020 Feb;59(1):102708.