文獻解讀：苜蓿單核轉(zhuǎn)錄組揭示時空共生知覺和早期反應(yīng)
期刊：nature plants
影響因子：15.8
主要技術(shù)：植物單細胞抽核測序
導(dǎo)語
豆科植物根瘤菌共生關(guān)系的建立需要時間和細胞類型特異性地精確協(xié)調(diào)復(fù)雜的反應(yīng)。遇到根瘤菌后，宿主植物中基因表達水平在最初幾小時內(nèi)發(fā)生快速變化，為植物關(guān)閉防御并與微生物形成共生關(guān)系做好準備。在這里，我們應(yīng)用單核 RNA 測序技術(shù)對根瘤菌處理后30分鐘、6小時和24 小時的苜蓿根系進行了表征。我們發(fā)現(xiàn) 30 分鐘時表皮和皮層發(fā)生了劇烈的全局基因表達重編程，這些變化中的大多數(shù)在6小時內(nèi)恢復(fù)。此外，在非濃縮細胞因子處理后，植物防御反應(yīng)基因在30分鐘內(nèi)被激活，隨后在6小時內(nèi)被抑制。我們發(fā)現(xiàn)，在接種點頭因子后30分鐘，招募根瘤菌所需的黃酮合成酶基因在皮層細胞中高度表達，而在其他類型的細胞中則沒有。共生固氮基因富集的基因模塊結(jié)果表明，MtFER(MtFERONIA)和LYK3(LysM域受體樣激酶3)對共生信號具有相似的響應(yīng)。我們進一步發(fā)現(xiàn)，MtFER可以被LYK3磷酸化，并參與根瘤菌共生。我們的研究結(jié)果擴大了我們在單細胞水平上對動態(tài)時空共生反應(yīng)的理解。
技術(shù)服務(wù)
植物單細胞抽核測序
研究結(jié)果
1. snRNA-seq揭示了苜蓿根的細胞異質(zhì)性
為了分析早期反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組重編程，我們在7日齡的樹干樹幼苗上接種了NFs。然后收集處理后0.5h（hpt）、6 hpt和24 hpt的根系敏感區(qū)（NFs），并接種緩沖結(jié)瘤培養(yǎng)基（BNM）作為模擬對照，制備snRNA-seq文庫（圖1a）。我們在4個文庫中共獲得了25276個高質(zhì)量的單核轉(zhuǎn)錄組，覆蓋30469個基因，每個核的中位基因為1018個，每個核的中位唯一分子標識符（UMIs）為1390個（補充數(shù)據(jù)1）。整合scVI數(shù)據(jù)后，鑒定出10個細胞簇（圖1b和補充圖1）。然而，我們發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）圖中，簇0和簇3難以區(qū)分；即使是聚類0中最特異性表達的基因在聚類3中也傾向于上調(diào)（補充圖1），這導(dǎo)致我們合并了這兩個細胞簇，從而得到了9個細胞簇（圖1c）。對于聚類注釋，我們使用了之前在M. truncatula中描述的15個細胞類型特異性標記（補充表1），我們能夠?qū)⒋蟛糠志垲惙峙涞揭粋�特定的細胞類型（圖1d和擴展數(shù)據(jù)圖1）。
圖 1
2. 廣泛表達的基因反應(yīng)模式的分析
為了研究早期信號通路中基因的反應(yīng)模式，我們根據(jù)每個細胞簇中不同時間點的表達情況，將4個時間點的1868個基因分為6個基因類別（圖2a和補充數(shù)據(jù)3）。共有838個不能準確地分配到這六個類別的基因被丟棄（方法）。從第2類到第6類的5個基因類別在所有細胞簇中都表現(xiàn)出相似的表達模式（圖2b）。接下來，我們研究了每種細胞類型對NFs的反應(yīng)。通過整合四個snRNA數(shù)據(jù)集從不同的時間點，與上述結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組在0.5 hpt顯示最低的相似性與其他時間點，表明根經(jīng)歷了廣泛的轉(zhuǎn)錄組重編程迅速NFs刺激和逐步恢復(fù)后6hpt（圖. 2c和補充圖.6）。之前的全根研究21也揭示了根瘤菌接種后1h的瞬時重編程，我們的結(jié)果表明，瞬時重編程在表皮和皮質(zhì)細胞中最為明顯，突出了這兩種細胞類型在NFs感知中的重要作用（補充圖6）。我們還發(fā)現(xiàn)，在0.5 hpt時的時間點特異性上調(diào)基因數(shù)量最高，證實了0.5 hpt在早期反應(yīng)中的唯一性（圖2d和補充數(shù)據(jù)4）。我們通過添加一個新的生物復(fù)制來驗證了這些發(fā)現(xiàn)，并通過使用完全基于組合的方法（方法）分析兩個重復(fù)的數(shù)據(jù)集，獲得了高度一致的結(jié)果(擴展數(shù)據(jù)圖4。值得注意的是，對這些誘導(dǎo)基因的基因功能富集分析顯示，在0.5 hpt時，幾乎所有分化的細胞類型（除中柱亞型簇8外）都誘導(dǎo)了植物防御相關(guān)通路，特別是在表皮和皮質(zhì)中。在6 hpt時，這些細胞在表皮中仍然活躍(圖2e和補充圖7–9)。
圖 2
3. 表皮細胞的一種亞型是SNF所必需的
通過重新聚類，表皮可進一步分為兩種亞細胞類型（亞簇1-0和1-1亞簇）（圖3a)。在所有四個樣本中都發(fā)現(xiàn)了這兩個子簇，這表明在應(yīng)用NFs之前，差異導(dǎo)致了兩個子簇的差異（圖3b）。此外，我們的列表中 1-1specifically 表達的基因 GH9CI的 GUS 信號主要標記成熟區(qū)的根毛和表皮細胞(圖3c)，這與擬南芥根毛和表皮中根毛標記基因 AtGH9Cl的表達模式一致。與根毛在根瘤菌感染初期的重要作用一致，我們發(fā)現(xiàn)已知SNF 基因在子集群 1-1中的比例顯著高于 1-0(圖 3d、e和補充數(shù)據(jù)2)。此外，與叢枝菌根共生(AMS)相關(guān)的GO功能也被富集(圖3f)。
圖 3
4. MtFER與LYK3共表達
為了進一步探索它們的功能，我們在0.5hpt時提取了表皮和皮質(zhì)細胞，以構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)(圖4a和補充數(shù)據(jù)7)。結(jié)瘤所需的乙烯響應(yīng)因子2（ERN2），PUB1和LYK3圖4a、c）MtFER（Medtr7g073660），擬南芥鐵藻的明顯同源物（擴展數(shù)據(jù)圖6），也在LYK3的模塊中被發(fā)現(xiàn)。LYK3可以磷酸化PUB1，并在早期反應(yīng)中調(diào)節(jié)結(jié)瘤。此外，我們發(fā)現(xiàn)這三個基因的表達水平均在0.5 hpt時達到峰值，隨后逐漸下降，這表明MtFER可能與PUB1和LYK3發(fā)生相互作用（圖4d）。
圖 4
5. MtFER的表達模式與LYK3相似
我們注意到pMtFER：GUS在根尖高表達，而pLYK3：：GUS在該區(qū)域弱表達（圖5a和擴展數(shù)據(jù)圖7）。有趣的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，在酵母雙雜交（Y2H）實驗中，MtFER蛋白可以與LYK3相互作用（圖5b）。當(dāng)LYK3-FLAG和MtFER-HA在本煙草葉片中共表達時，我們通過共免疫沉淀（Co-IP）進一步證實了相互作用（圖5c）。最后，我們在體外激酶實驗中發(fā)現(xiàn)LYK3可以磷酸化MtFER（圖5d）。我們的研究結(jié)果表明，根瘤菌共生過程中對MtFER的需求可能與其與LYK3的相互作用有關(guān)。
圖 5
參考文獻：
[1]Liu Z , Yang J ,Long, YanpingZhang, ChiWang, DapengZhang, XiaoweiDong, WentaoZhao, LiLiu, ChengwuZhai, JixianWang, Ertao.Single-nucleus transcriptomes reveal spatiotemporal symbiotic perception and early response in Medicago[J].Nature Plants, 2023, 9(10):1734.
