3T3 細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)原理及步驟介紹
3T3 細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)背景
光毒性（Phototoxicity）是指皮膚接觸化學(xué)物質(zhì)后暴露于紫外線下引發(fā)的毒性反應(yīng)，可分為光刺激性（Photoirritation）、光過敏性（Photoallergy）和光遺傳毒性( Photogenotoxicity）。
在化妝品，特別是防曬和美白產(chǎn)品中，光毒性風(fēng)險(xiǎn)較高，因此產(chǎn)品開發(fā)者對其評估極為重視。特別是在2024年國家藥監(jiān)局發(fā)布的新措施后，光毒性評估成為化妝品安全性評價(jià)的關(guān)鍵部分。
傳統(tǒng)光毒性評價(jià)方法依賴動物實(shí)驗(yàn)，但周期長、成本高，動物個(gè)體化差異影響大，且不符合國內(nèi)外關(guān)于試驗(yàn)動物的3R原則（減少、替代和優(yōu)化）。隨著3R原則的推廣，體外替代法逐漸取代傳統(tǒng)方法。3T3 細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)(3T3 Neutral Red Uptake (NRU) Phototoxicity assay, 3T3 NRU Assay) 是最早通過歐盟體外替代試驗(yàn)有效性驗(yàn)證中心( European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM) 驗(yàn)證并被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD) 的“化學(xué)物質(zhì)毒性試驗(yàn)指南”收錄的體外光毒性檢測方法。在OECD 指導(dǎo)原則432和INVITTOX實(shí)驗(yàn)方案78中詳細(xì)描述了實(shí)驗(yàn)方法和預(yù)測模型。我們國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2016 年11 月7 日發(fā)布了《化妝品化學(xué)原料體外3T3 中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法》并把它作為第18項(xiàng)毒理學(xué)試驗(yàn)方法納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》。
光毒性（Phototoxicity）是指皮膚接觸化學(xué)物質(zhì)后暴露于紫外線下引發(fā)的毒性反應(yīng)，可分為光刺激性（Photoirritation）、光過敏性（Photoallergy）和光遺傳毒性( Photogenotoxicity）。
在化妝品，特別是防曬和美白產(chǎn)品中，光毒性風(fēng)險(xiǎn)較高，因此產(chǎn)品開發(fā)者對其評估極為重視。特別是在2024年國家藥監(jiān)局發(fā)布的新措施后，光毒性評估成為化妝品安全性評價(jià)的關(guān)鍵部分。
傳統(tǒng)光毒性評價(jià)方法依賴動物實(shí)驗(yàn)，但周期長、成本高，動物個(gè)體化差異影響大，且不符合國內(nèi)外關(guān)于試驗(yàn)動物的3R原則（減少、替代和優(yōu)化）。隨著3R原則的推廣，體外替代法逐漸取代傳統(tǒng)方法。3T3 細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)(3T3 Neutral Red Uptake (NRU) Phototoxicity assay, 3T3 NRU Assay) 是最早通過歐盟體外替代試驗(yàn)有效性驗(yàn)證中心( European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM) 驗(yàn)證并被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD) 的“化學(xué)物質(zhì)毒性試驗(yàn)指南”收錄的體外光毒性檢測方法。在OECD 指導(dǎo)原則432和INVITTOX實(shí)驗(yàn)方案78中詳細(xì)描述了實(shí)驗(yàn)方法和預(yù)測模型。我們國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2016 年11 月7 日發(fā)布了《化妝品化學(xué)原料體外3T3 中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法》并把它作為第18項(xiàng)毒理學(xué)試驗(yàn)方法納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》。
在藥品評價(jià)領(lǐng)域，歐洲藥監(jiān)局(EMA, European Medicines Agency)和國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH, The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use ）指導(dǎo)原則的生效，3T3 細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗(yàn)在藥物研發(fā)工業(yè)界也被廣泛使用。
經(jīng)過多年來數(shù)據(jù)積累發(fā)現(xiàn)3T3 成纖維細(xì)胞中性紅攝取試驗(yàn)（3T3 NRU -ASSAY）與體內(nèi)動物光毒性試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性好，且操作簡單、費(fèi)用低、重現(xiàn)性好、試驗(yàn)周期短，它是動物皮膚光毒性試驗(yàn)的一種較好的體外替代方法，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于化妝品、藥品的光毒性安全評價(jià)。
3T3細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)原理和判斷標(biāo)準(zhǔn)
該方法的原理是通過測定在非光照( -Irr) 和光照( + Irr) 條件下，受試物對永生化小鼠成纖維細(xì)胞BalB /c 3T3（BALB/c 3T3 mouse fibroblast cell line）毒作用后，對細(xì)胞吸收中性紅的能力變化繪制細(xì)胞毒性曲線，使用Phototox Version 2.0 軟件計(jì)算各個(gè)受試物的光刺激因子（PIF）和平均光效應(yīng)（MPE），根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)表1對受試物光毒性做出預(yù)測判斷。
3T3 細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)流程
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）于2022年根據(jù)OECD 指導(dǎo)原則432和INVITTOX實(shí)驗(yàn)方案78在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部成功建立、驗(yàn)證并一直穩(wěn)定執(zhí)行3T3細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)，為國內(nèi)外客戶提供了化妝品原料和產(chǎn)品、潛在新藥化合物等光毒性嚴(yán)謹(jǐn)可信的評估結(jié)果。
主要實(shí)驗(yàn)材料
細(xì)胞株：BALB/3T3 clone A3 (ATCC :CCL-163 ™ ，BALB/3T3 clone A31 - CCL-163 | ATCC）.
培養(yǎng)條件: DMEM (Cat#:30-2002) +10% FBS +1% P/S,圖 1 3T3 成纖維細(xì)胞形態(tài)
細(xì)胞株：BALB/3T3 clone A3 (ATCC :CCL-163 ™ ，BALB/3T3 clone A31 - CCL-163 | ATCC）.
培養(yǎng)條件: DMEM (Cat#:30-2002) +10% FBS +1% P/S,圖1 3T3 成纖維細(xì)胞形態(tài)
細(xì)胞株：BALB/3T3 clone A3 (ATCC :CCL-163 ™ ，BALB/3T3 clone A31 - CCL-163 | ATCC）.
培養(yǎng)條件: DMEM (Cat#:30-2002) +10% FBS +1% P/S,圖1 3T3 成纖維細(xì)胞形態(tài)
驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)品，2 種陽性物質(zhì)，1 種陰性物質(zhì)，均采購于 MCE.
Instrumentation (Light source): Honle SOL500 RF2 (solar simulator 400W) and Filter H1 (UV filter at 320 nm)
主要儀器：紫外光源 HONLE 紫外線設(shè)備 SOL500，BMG 酶標(biāo)儀和 Olympus 倒置顯微鏡CKX53.
96-孔板受試物布局：
標(biāo)準(zhǔn)品 3T3 中性紅光毒性攝取試驗(yàn)
對數(shù)生長期的 BalB/c 3T3 成纖維細(xì)胞消化稀釋用 Multidrop™ Combi 鋪板至 96 孔板（-irr 細(xì)胞板和+irr 細(xì)胞板）并培養(yǎng)過夜，鏡檢如圖 2
將受試物稀釋到各自最高劑量，1xPBS 進(jìn)行 3.162 倍梯度稀釋后，用 Bravo 分別轉(zhuǎn)移 100uL到-irr 細(xì)胞板和+irr 細(xì)胞板，與細(xì)胞在 37°培養(yǎng)箱共孵育 1 小時(shí)后，+irr 細(xì)胞板暴露于太陽模擬器下照射( UVA 總能量為 5 J·cm 2 ) 50 分鐘，-irr 細(xì)胞板放置于相同溫濕度條件下的黑暗處，結(jié)束后更換新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。
第三天輕輕拍掉培養(yǎng)基，每個(gè)孔中加入 100μL 含有中性紅的培養(yǎng)基并在 37℃孵育 3 小時(shí)，用 1xPBS 洗凈殘留的中性紅，此時(shí)可以觀察到受試物對中性紅吸附的梯度如圖 3。
第三天輕輕拍掉培養(yǎng)基，每個(gè)孔中加入 100μL 含有中性紅的培養(yǎng)基并在 37℃孵育 3 小時(shí)，用 1xPBS 洗凈殘留的中性紅，此時(shí)可以觀察到受試物對中性紅吸附的梯度如圖 3。
每孔加入 150μL 中性紅洗脫液如圖 4 并在室溫下震蕩 10 分鐘，用 BMG 酶標(biāo)儀讀取 540nm 波長下吸光度值，利用 Phototox 2. 0 軟件計(jì)算光刺激因子( PIF)和平均光效應(yīng)( MPE)預(yù)測受試物的光毒性結(jié)果。
試驗(yàn)結(jié)果
在評估方法建立和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，我們驗(yàn)證了 2 種陽性物質(zhì)，1 種陰性物質(zhì)，檢測結(jié)果如下：
根據(jù) OECD 指導(dǎo)原則 432 和 INVITTOX 實(shí)驗(yàn)方案 78，受試物 OD540 數(shù)值有一定的數(shù)據(jù)窗口并且 IC50 數(shù)值也在波動范圍內(nèi)，根據(jù) PIF 光刺激因子可以預(yù)測受試物的光毒性和指導(dǎo)原則結(jié)果一致，由此證明在 SNB 實(shí)驗(yàn)室建立的評估方法可靠。同時(shí)在接下來的試驗(yàn)中，我們對陽性受試物鹽酸氯丙嗪 CPZ 數(shù)據(jù)結(jié)果持續(xù)追蹤如圖 5 和表 4，不管是 3T3 細(xì)胞狀態(tài)、鹽酸氯丙嗪 CPZ圖 4 加入中性紅洗脫液受試物和關(guān)鍵試劑批次的更換（比如血清），陽性受試物都保持了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，證明SNB實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性、數(shù)據(jù)的可靠性和可追溯性。
表 4 鹽酸氯丙嗪 CPZ 數(shù)據(jù)結(jié)果追蹤
總結(jié)：
在化妝品原料和上市產(chǎn)品評價(jià)領(lǐng)域，由于受試物大多采用外用涂抹，所以非常重視這類受試物的光毒性評價(jià)，在新藥研發(fā)和藥品評價(jià)領(lǐng)域，這方面的研究和評價(jià)也越來越受重視。體外 3T3 細(xì)胞光毒性中性紅攝取試驗(yàn)不僅能為化妝品安全性提供保證，還能減少實(shí)驗(yàn)動物的使用，同時(shí)避免因個(gè)體差異造成的誤差，評估結(jié)果具有可靠性、穩(wěn)定性和可追溯性。
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