案例解析：小腸類器官與胚胎發(fā)育的單細胞研究
引言
大型多細胞系統(tǒng)的實時成像是現(xiàn)代生物學研究中的一個重要挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)顯微鏡技術(shù)在提供高分辨率三維圖像方面常有不足，尤其是對于需要最小光毒性的深層樣本。開發(fā)開放式多樣本雙視角光片顯微鏡在這一領(lǐng)域取得了顯著進展。本文探討了這一創(chuàng)新顯微鏡系統(tǒng)的功能和應(yīng)用。
腸類器官
利用光片顯微鏡對模擬腸道上皮的復雜結(jié)構(gòu)——腸類器官進行成像，追蹤細胞動態(tài)和分化過程。顯微鏡詳細展示了數(shù)天內(nèi)的隱窩和絨毛形成，為細胞周期動態(tài)和類器官內(nèi)不同細胞類型成熟提供了見解。
圖一：
a.表達hGem-mVenus和hCdt1-mCherry的腸類器官（左），染色顯示溶菌酶（Lys）和DLL1（中）。
b.表達hCdt1-mCherry的腸類器官的最大投影圖（MIP），疊加了反向追蹤細胞的軌跡，以時間進行顏色編碼。虛線對應(yīng)于z投影。
c.對腸類器官的檢測1、檢測2及融合數(shù)據(jù)的z投影，疊加了反向追蹤細胞的軌跡，顯示時間進程。
d.腸隱窩的放大圖，星號表示同時陽性表達hCdt1、Dll1和溶菌酶的細胞。
e.單個細胞的hCdt1、溶菌酶和Dll1強度隨時間的定量分析：陽性隱窩細胞（e）；
f.陽性絨毛細胞（f）和陽性隱窩細胞（g）。
圖二：
e) 對在最后時間點位于隱窩中的三重陽性細胞（hCdt1、Dll1和溶菌酶）的hCdt1強度隨時間的量化。每種顏色代表一個單細胞（n = 4）。
f) 對在最后時間點位于絨毛中的hCdt1陽性細胞的hCdt1強度隨時間的量化。每種顏色代表一個單細胞（n = 7）。
g) 對在最后時間點位于隱窩中的hCdt1陽性細胞的hCdt1強度隨時間的量化。每種顏色代表一個單細胞（n = 9）。
文中對表達FUCCI2的腸類器官進行了活體成像，并進行了終點固定和免疫熒光評估其細胞類型組成。通過3D配準將最后一個活體成像時間點與染色后的類器官疊加，使用Paneth細胞標記溶菌酶（Lys）和分泌細胞標記Dll1來檢測感興趣的細胞。三重陽性細胞（hCdt1+/Lys+/Dll1+）被反向追蹤以監(jiān)測Paneth細胞的成熟及其在G0/G1期的細胞周期停滯。成熟Paneth細胞的初始位置預測了類器官隱窩的最終位置。
接下來，比較了隱窩中的hCdt1+/Lys+/Dll1+ Paneth細胞與hCdt1+/Lys−/Dll−細胞（主要是腸干細胞）和類器官絨毛中的細胞（主要是腸細胞）。進一步識別了那些在記錄開始前已經(jīng)終末分化的腸細胞和Paneth細胞。對于其他細胞，特別是在隱窩中的細胞，確定了它們出現(xiàn)的時間，從而能夠追蹤它們的完整成熟過程，固定時的平均細胞周期長度為21.9小時。評估細胞類型特定的出現(xiàn)時間，得出結(jié)論，Paneth細胞比單陽性hCdt1細胞出現(xiàn)得更早，表明特定的細胞周期長度和特定的分化順序。這種對細胞行為和成熟過程的洞見在沒有活體成像和免疫熒光結(jié)合整個類器官體積的情況下是無法實現(xiàn)的。
胚狀體
胚狀體是模擬早期胚胎發(fā)育的三維干細胞聚集體。光片顯微鏡捕捉到這些致密結(jié)構(gòu)的單細胞分辨率圖像，揭示了細胞運動和形態(tài)變化。追蹤胚狀體內(nèi)單個細胞的能力突顯了光片顯微鏡在研究動態(tài)發(fā)育過程中的應(yīng)用潛力。
圖三：
h. 表達Lck-GFP的胚體在三個時間點（42小時Wnt前期，66小時Wnt中期和90小時Wnt后期）的z平面圖像。
i. 在h中部分突出顯示的胚體細胞，分別為種植后42小時、66小時和90小時。箭頭指示細胞的突起。
j. 使用Cellpose軟件對種植后42小時的Lck-GFP陽性細胞進行的3D代表性分割。
k. 比較種植后42小時、66小時和90小時的細胞長軸和短軸的比率，圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。
l. 胚體的最大投影圖（MIP），疊加了隨時間追蹤的細胞。
m. 細胞速度（μm/h）的小提琴圖，以觀察窗口分組，圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。
n. 在42小時、66小時和90小時種植后拍攝的胚體細胞軌跡，中心對齊到坐標系原點，并以顏色編碼表示時間進程。
o. 在各個成像窗口中，Lck-GFP胚體細胞的軌跡長度。細胞速度（μm/h）的分組小提琴圖，圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。
p. Lck-GFP嵌合胚體在各個成像窗口中，所有細胞的平均均方位移（m.s.d.）。比例尺：50 μm（a–d, h, j, l）；20 μm（i）。
圖四：
h) 對懸浮狀態(tài)下成像的胚體在三個不同時間窗口中長軸和短軸比率的比較。測量在每個成像窗口（42小時、66小時或90小時）內(nèi)的3個胚體的3D體積上進行，共33個時間點。分別對3753個數(shù)據(jù)點（42小時）、3340個數(shù)據(jù)點（66小時）和8861個數(shù)據(jù)點（90小時）進行了分析。圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。
i) 胚體發(fā)育過程中在三個不同時間窗口內(nèi)成像的細胞速度的小提琴圖，顯示了中位數(shù)（圖中數(shù)值）及第一和第三四分位數(shù)。每個觀察窗口中追蹤的數(shù)據(jù)點數(shù)量（來自3個單獨的胚體）如下：n = 622（42小時），n = 562（66小時），n = 539（90小時）。胚體在懸浮狀態(tài)下成像。
與其他樣本不同，胚狀體是密集結(jié)構(gòu)，因此難以單細胞分辨率成像。文中使用這個模型系統(tǒng)展示顯微鏡獲取單個細胞運動和形態(tài)特征的能力。標準胚狀體實驗方案使用Wnt激活劑（Chiron99021）以提高中胚層形成效率。這可能會誘導類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的行為并增加細胞遷移。為了分析胚狀體內(nèi)的細胞形態(tài)，文中生成了嵌合體，其中一部分細胞（約10%）表達膜報告基因（Lck-GFP）。記錄胚狀體在Wnt脈沖前、中和后的動態(tài)。此外，將胚狀體嵌入40%的Matrigel中，以防止樣本腔室中的機械旋轉(zhuǎn)。使用Cellpose對單個細胞進行3D分割，從而計算長軸/短軸比率，顯示細胞伸長在Chir處理期間達到峰值。
后期階段，部分細胞顯示出較長的細胞突起。這一觀察結(jié)果提出了細胞運動性在胚狀體發(fā)育過程中增加的假設(shè)。使用Fiji插件Mastodon，追蹤了Lck-GFP陽性細胞，發(fā)現(xiàn)遷移的中位速度在胚狀體發(fā)育過程中增加。在Wnt脈沖期間，遷移速度的中位數(shù)增加了1.4倍。Wnt激活后成像的胚體展示了最長的軌跡長度。對3D均方位移的評估表明，從90小時開始追蹤的細胞速度增加，并且遷移行為發(fā)生了變化。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，遷移增加，提示W(wǎng)nt激活增強了細胞運動性并可能在胚體中促進了協(xié)調(diào)遷移。觀察到的細胞形態(tài)變化和運動性增加，部分表明了類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。這一趨勢在嵌入Matrigel中的胚體和懸浮狀態(tài)下的胚體之間保持一致。
開放式多樣本雙視角光片顯微鏡
設(shè)計和特點
開放式多樣本雙視角光片顯微鏡結(jié)合了雙重照明和雙重檢測鏡頭，以實現(xiàn)多角度的高分辨率成像。其主要特點包括：
雙重照明和檢測
系統(tǒng)采用兩個相對的照明鏡頭和兩個檢測鏡頭，從不同方向捕捉圖像。這種配置最小化了偽影，特別適用于厚大標本的高質(zhì)量成像。
開放式設(shè)計
這種設(shè)計允許從頂部輕松訪問樣本，便于在成像過程中進行樣本操作和添加試劑。
多孔安裝系統(tǒng)
可定制的多孔樣本支架使得多樣本的高通量成像成為可能，這對于需要并行處理和比較的實驗至關(guān)重要。
相較傳統(tǒng)顯微鏡的優(yōu)勢
高通量和低光毒性
光片顯微鏡通過薄光片照明樣本，固有地減少了光毒性，這對于長期的實時成像至關(guān)重要。雙視角設(shè)置在保持低光曝光的同時進一步提升了圖像質(zhì)量。多孔系統(tǒng)允許同時成像多個樣本，與傳統(tǒng)顯微鏡方法相比顯著提高了通量。
詳細的單細胞分析
顯微鏡的高分辨率和雙視角功能使得在大而厚的樣本中進行詳細的單細胞分析成為可能。這一特性對研究異質(zhì)生物過程尤其有價值，因為需要在長時間內(nèi)觀察細胞行為和相互作用。
靈活性和定制化
開放式設(shè)計和可定制的樣本支架提供了處理不同類型樣本和實驗設(shè)置的靈活性。這種適應(yīng)性使顯微鏡適用于從類器官研究到發(fā)育生物學和癌癥研究的廣泛生物學研究。
開放式多樣本雙視角光片顯微鏡代表了實時成像技術(shù)的重大進展。未來的增強可能包括整合自適應(yīng)光學以進一步提升圖像質(zhì)量，以及結(jié)合激光消融或光遺傳刺激技術(shù)以在成像過程中操縱樣本。此外，該系統(tǒng)處理光學透明標本的能力可能擴展其在深層組織成像中的應(yīng)用。
開放式多樣本雙視角光片顯微鏡的開發(fā)和成功應(yīng)用標志著生物成像領(lǐng)域的關(guān)鍵一步。通過在長時間內(nèi)提供大型多細胞系統(tǒng)的高分辨率三維圖像，這一技術(shù)為理解細胞水平上的復雜生物過程開辟了新的途徑。
閱讀原文：
Moos, F., Suppinger, S., de Medeiros, G. et al. Open-top multisample dual-view light-sheet microscope for live imaging of large multicellular systems. Nat Methods 21, 798–803 (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02213-w
參考文獻：（上下滑動查看更多）
1. Suppinger, S. et al. Multimodal characterization of murine gastruloid development. Cell Stem Cell 30, 867–884.e11 (2023).
2. Beccari, L. et al. Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids. Nature 562, 272–276 (2018).
3. van den Brink, S. C. & van Oudenaarden, A. 3D gastruloids: a novel frontier in stem cell-based in vitro modeling of mammalian gastrulation. Trends Cell Biol. 31, 747–759 (2021).
4. Pachitariu, M. & Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nat. Methods 19, 1634–1641 (2022).
5. Mastodon v.1.0.0-beta-26. GitHub https://github.com/mastodon- sc/mastodon (2022).
6. Hashmi, A. et al. Cell-state transitions and collective cell movement generate an endoderm-like region in gastruloids. eLife 11, e59371 (2022).
7. de Medeiros, G. et al. Multiscale light-sheet organoid imaging framework. Nat. Commun. 13, 4864 (2022).
17. Serra, D. et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature 569, 66–72 (2019).
8. Abe, T. et al. Visualization of cell cycle in mouse embryos with Fucci2 reporter directed by Rosa26 promoter. Development 140, 237–246 (2013).
相關(guān)產(chǎn)品
了解更多：徠卡顯微
