利用冷凍共聚焦光電聯(lián)用實(shí)現(xiàn)三維定位
Cryo ET（電子斷層掃描）是一種專用的透射電子顯微鏡技術(shù)，可以重建觀察區(qū)域的三維體積。借助先進(jìn)的冷凍EM（電子顯微鏡），圖像分辨率可以提升到令人難以置信的亞納米等級。因此，可以在細(xì)胞內(nèi)的原生環(huán)境中研究蛋白質(zhì)以及其他生物分子，從而揭示尚未探明的分子機(jī)制。由于細(xì)胞和組織必須薄到能夠透過電子，樣品必須進(jìn)行切片以獲取足夠薄的樣品體積（薄層）。為對樣品中的靶區(qū)進(jìn)行精確的三維定位，冷凍共聚焦顯微鏡是必不可少的工具。
以下部分，我們將描述冷凍電子斷層掃描工作流程的主要步驟，以及如何通過冷凍共聚焦顯微鏡定位靶區(qū)并進(jìn)行切片，以提高整個工作流程的可靠性。
在EM網(wǎng)格上培養(yǎng)細(xì)胞通常，在涂有多孔碳膜（例如 QuantifoilR）或二氧化硅（SiO2）膜的金質(zhì)或鈦金網(wǎng)格上植入急性分離或培養(yǎng)的細(xì)胞（圖1，Mahamid等人，2019）在后續(xù)步驟中，鈦金屬和二氧化硅似乎更加堅硬而且穩(wěn)定，無需額外添加碳層（Toro-Nahuelpan 2019）
網(wǎng)格通過Poly-L-Lysin或纖連蛋白（Fibronectin）實(shí)現(xiàn)生物激活，胰蛋白酶解離細(xì)胞在前一晚植入，以便在后續(xù)步驟中附著在碳層表面（Mahamid等人，2019）。
添加微型圖案
為進(jìn)入細(xì)胞樣品以成功實(shí)現(xiàn)FIB切片并在冷凍TEM中開展后續(xù)分析，必須確保相關(guān)細(xì)胞位于網(wǎng)格方格的中心位置或其附近。但細(xì)胞喜歡在網(wǎng)格條上生長或者集簇生長，因此不適合進(jìn)行FIB切片和電子透射分析。為了克服這一挑戰(zhàn)，微型圖案技術(shù)允許用戶控制細(xì)胞在碳膜（圖2）上的位置和分布，提高相關(guān)工作流程的可靠性。
網(wǎng)格表面涂有聚乙二醇（PEG），可防止生物材料附著。利用紫外激光移除該涂層，即可對細(xì)胞的黏附進(jìn)行針對性控制，保證FIB切片以及TEM的可操作性（Toro-Nahuelpan 2019）。此外，可以創(chuàng)建特定圖案，從而影響整個細(xì)胞結(jié)構(gòu)并且有助于使用冷凍電子顯微鏡研究生物力學(xué)現(xiàn)象。
圖2：有/無微型圖案的細(xì)胞分布情況左圖：分布不均的細(xì)胞（小鼠A9成纖維細(xì)胞，使用Alexa Fluor 488 Phalloidin標(biāo)記，以顯示纖維狀肌動蛋白）。右圖：網(wǎng)格方格中心定位精確的細(xì)胞，可進(jìn)行FIB（成纖維細(xì)胞黏附在纖維蛋白原微型圖案表面；圖片由Alvéole與德國漢堡CSSB中心教授Kay Grünewald博士共同提供。）
投入冷凍
為在固定用于電子顯微鏡檢查的同時確保樣品接近原生狀態(tài)，細(xì)胞必須極速冷凍，以免產(chǎn)生破壞性的冰晶。這個過程稱為玻璃化，因?yàn)楸兂蔁o結(jié)晶的玻璃狀（玻璃體）
為讓樣品細(xì)胞達(dá)到這種效果，網(wǎng)格必須快速投浸到適當(dāng)?shù)睦鋬鰟ㄍǔ橐彝�，或者乙烷和丙烷）�?/span>。1981年，Jacques Dubochet發(fā)表了首個手動吸液和投入冷凍方法，該方法仍獲廣泛使用以獲取出色的結(jié)果（Dubochet, J.以及McDowall, A. W.，1981）。
在投入冷凍之前，必須去除多余的液體。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是使用濾紙實(shí)現(xiàn)受控吸液（圖3，Dubochet, J等人，1982；Bellare等人，1988；Frederik, P. M.等人，1989）。
圖3：在投入冷凍前，通過吸液處理對多余液體進(jìn)行受控移除。使用鑷子固定網(wǎng)格，并通過單獨(dú)步驟將吸液紙移向網(wǎng)格。吸液傳感器可以自動并反復(fù)執(zhí)行該過程。
市面上有多種不同的吸液設(shè)備，例如用于自動吸液和投入冷凍的Leica EM GP2。根據(jù)不同樣品類型的多種需求，可以使用多種涉及吸液步驟的樣品制備方案（另見此處）。
冷凍狀況下的存儲、裝載和轉(zhuǎn)移
玻璃化之后，樣品必須在整個工作流程期間處于冷凍狀況下。因此，必須對從存儲到轉(zhuǎn)移至不同成像系統(tǒng)的所有步驟進(jìn)行冷凍處理，以免樣品析晶和/或污染這尤其困難，因?yàn)檫@種低溫冷凍樣品會像磁鐵一樣吸引附近的濕氣和灰塵。研究人員和制造商付出巨大的努力來開發(fā)并提供解決方案，以便在工作流程的不同步驟中保證樣品安全。
樣品通常以四個為一組存儲在網(wǎng)格盒內(nèi)，而網(wǎng)格盒又保存在大型液氮（LN2）罐中的Falcon多孔試管中。還可以使用更為復(fù)雜的冰球系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)移并裝載到樣品架時，通常使用液態(tài)氮（LN2）。不幸的是，LN2往往會在一段時間后，因?yàn)榭諝庵械乃侄a(chǎn)生結(jié)晶冰污染。在轉(zhuǎn)移時，這些冰晶可能會附著到網(wǎng)格上，干擾隨后的切片和成像過程。此外，LN2內(nèi)部的能見度很低，因?yàn)樗诓粩嘁苿�，而且始終會有條紋。
因此，最好在LN2上部的氣相部分裝載并轉(zhuǎn)移樣品以保持冷凍條件，同時為裝載步驟（圖4）提供出色的可見性。
徠卡顯微系統(tǒng)在提供GN2（氣態(tài)氮）裝載和轉(zhuǎn)移設(shè)備方面擁有30多年的悠久歷史。新的冷凍顯微鏡套件就在這些經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開發(fā)而成，同時融合眾多客戶的反饋意見打造出先進(jìn)的轉(zhuǎn)移艙和夾具系統(tǒng)。
圖4：在冷凍顯微鏡套件轉(zhuǎn)移艙的GN2（氣態(tài)氮）環(huán)境中裝載網(wǎng)格。轉(zhuǎn)移艙的可見度在冷凍條件下不受干擾。
檢查樣品質(zhì)量和靶分布
在冷凍工作流程中，一般而言，EM操作時間尤其寶貴，因此對樣品進(jìn)行早期質(zhì)量檢查至關(guān)重要。許多因素會關(guān)系到樣品能否轉(zhuǎn)移到下一個工作流程步驟，包括碳箔的結(jié)構(gòu)完整性、玻璃化的質(zhì)量（包括冰層的厚度及其分布）、目標(biāo)細(xì)胞的存在、分布和可及性，以及目標(biāo)結(jié)構(gòu)的存在和定位。
所有這些參數(shù)均可通過基于相機(jī)的冷凍光學(xué)顯微鏡（例如THUNDER Imager EM Cryo-CLEM）或使用STELLARIS冷凍共聚焦顯微鏡上的相機(jī)模式來檢查（圖5）。
透射模式顯示網(wǎng)格、箔膜和細(xì)胞質(zhì)量，反射圖像顯示網(wǎng)格表面，尤其是呈現(xiàn)玻璃化質(zhì)量和冰層厚度，而熒光圖像可以提供有關(guān)不同靶蛋白的表達(dá)水平及其分布情況的信息。
圖5：不同模式呈現(xiàn)出網(wǎng)格的完整性以及靶分布。A——網(wǎng)格表面的反射圖像可以顯示碳膜或二氧化硅層的缺陷以及冰層的厚度。B——綠色熒光（線粒體）。C——液滴分布以實(shí)現(xiàn)高精度關(guān)聯(lián)D——通過Hoechst標(biāo)記的細(xì)胞核E——所有模式的疊加圖像細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。一個網(wǎng)格方格的邊長：90微米。
在LAS X Coral Cryo軟件工作流程中，用戶可以在引導(dǎo)下，通過不同圖像模式對整個網(wǎng)格自動創(chuàng)建清晰的合焦概覽圖像。
標(biāo)記標(biāo)志點(diǎn)、薄片點(diǎn)以及液滴中心
為了關(guān)聯(lián)冷凍LM（光學(xué)顯微鏡）的3D圖像以及后續(xù)的冷凍FIB-SEM/TEM圖像，首先需要獲取網(wǎng)格的概覽圖像以便大致對齊兩種模式的圖像（圖6）。這里，反射圖像非常重要，因?yàn)樗鼈冾愃朴赟EM圖像，但也可以使用透射圖像。中心標(biāo)記以及其他標(biāo)志點(diǎn)（例如碳層中的缺陷）有助于快速定位并對齊概覽圖。
圖6：以不同模式獲取整個網(wǎng)格的合焦概覽圖像，用于識別網(wǎng)格缺陷、對齊標(biāo)記和靶分布。中心標(biāo)記用實(shí)心箭頭表示，二氧化硅層中的主要缺陷用空心箭頭突出顯示。HeLa細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。藍(lán)色 – Hoechst染料，細(xì)胞核；綠色 — 線粒體綠色熒光探針，線粒體；紅色 - 深紅色液滴和Bodipy熒光染料，脂滴。一個網(wǎng)格方格的邊長：90微米。完整網(wǎng)格直徑：3毫米。
其次，需要超分辨率的共聚焦3D圖像。這些圖像堆棧用于在潛在薄片位置的范圍內(nèi)執(zhí)行高精度關(guān)聯(lián)。完成概覽圖對齊后，可以找到3D共聚焦堆棧的正確位置以便后續(xù)進(jìn)行高精度關(guān)聯(lián)這樣做的前提是必須提供圖像相對于概覽圖以及相對于彼此的位置。這就是Coral Cryo軟件工作流程之后的處理步驟（圖7）。
圖7：相機(jī)概覽圖像與共聚焦Z-堆棧相機(jī)和共聚焦圖像的組合含有XY坐標(biāo)位置，因此可以匹配。所有圖像都包含在Coral Cryo軟件工作流程期間創(chuàng)建的相關(guān)項目文件夾中。HeLa細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。藍(lán)色 – Hoechst染料，細(xì)胞核；綠色 — 線粒體綠色熒光探針，線粒體；紅色 - 深紅色液滴和Bodipy熒光染料，脂滴。一個網(wǎng)格方格的邊長：90微米。完整網(wǎng)格直徑：3毫米。
必須組合相機(jī)概覽圖像和超分辨率3D圖像以檢索靶區(qū)位置并在FIB-SEM上定義切片位置。這個步驟非常重要，因?yàn)樵跇?biāo)準(zhǔn)FIB-SEM中，無法看到熒光以及相應(yīng)的靶區(qū)點(diǎn)位。
EM（電子顯微鏡）制造商近期研發(fā)出一種集成了FIB-SEM功能的熒光顯微鏡，可以作為在切片過程中通過檢查熒光來提高工作流程的可靠性和準(zhǔn)確性的一種絕佳選擇。不過，這些系統(tǒng)并不具備必要的分辨率以及采集模式的靈活性，無法像單獨(dú)的共聚焦系統(tǒng)那樣實(shí)現(xiàn)精確的3D定位。
如何關(guān)聯(lián)并檢索薄片位置
作為常用的最低標(biāo)準(zhǔn)，研究人員使用LM圖像的屏幕截圖在EM上檢索靶區(qū)的XY坐標(biāo)。不幸的是，并排比較圖像不僅費(fèi)力耗時而且很容易出錯，因此并不可靠。身為工作流程提供商，徠卡顯微系統(tǒng)致力于通過THUNDER Imager EM Cryo-CLEM來改善這種情況。研究人員可以在圖像上定位標(biāo)志點(diǎn)和靶區(qū)標(biāo)記，然后以開放EM格式的完整坐標(biāo)集導(dǎo)出。首先，這個流程適用于2D圖像，因此合乎邏輯的下一步驟就是提高分辨率并將坐標(biāo)系擴(kuò)展到3D坐標(biāo)。
對于高精度關(guān)聯(lián)和3D定位，目前廣泛采用的是基于液滴的方法（Alegretti等人，2020；Klumpe等人，2021年；Bieber, A.，Capitanio, C等人，2021）液滴通常在玻璃化之前添加到細(xì)胞中，可在LM和EM中觀察到，用于通過XYZ坐標(biāo)對齊圖像堆棧，作為圖像數(shù)據(jù)相關(guān)性的基礎(chǔ)，從而正確定位FIB切片窗口（圖8）。
典型液滴的尺寸為1微米，完全呈球形，這使其中心坐標(biāo)能夠進(jìn)行亞衍射擬合。通過SEM中的背散射電子，可以更清晰地觀察到含有金屬的微滴，從而將它們與大小相似的冰晶區(qū)分開來。優(yōu)先選擇液滴，使其熒光發(fā)射不同于實(shí)際靶的熒光發(fā)射，以便能夠更好地分辨。
圖8：3D共聚焦圖像（左）和俯視SEM圖像（右）的最大投影。熒光液滴（1微米）在兩種模式中均可以觀察到，因此可以用于對齊數(shù)據(jù)。SEM圖像細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung和Ievgeniia Zagoriy友情提供。一個網(wǎng)格方格的邊長：90微米。
要使用來自冷凍LM和FIB-SEM的3D數(shù)據(jù)，在冷凍LM的引導(dǎo)下，進(jìn)行薄片制備，可以使用一款開源軟件（3D關(guān)聯(lián)工具箱，簡稱3DCT，Jan Arnold等人，2016）。
將冷凍LM圖像載入到在FIB-SEM上運(yùn)行的該軟件中。二維LM概覽圖和SEM圖像之間的三點(diǎn)關(guān)聯(lián)用于初步定位。之后，使用離子束獲取相關(guān)視場，并手動點(diǎn)擊LM堆棧和FIB圖像中的相同液滴圖10顯示了一張LM圖像和一張F(tuán)IB圖像，其中的靶區(qū)點(diǎn)位以及液滴可以在定位軟件中重現(xiàn)其排列組合。
圖9：在LM和FIB圖像中關(guān)聯(lián)標(biāo)記。左圖：點(diǎn)擊觀察結(jié)構(gòu)周圍的液滴，并在3D圖像中執(zhí)行質(zhì)心定義（白圈中的綠點(diǎn)）計算得到的位置隨后投影到FIB圖像（右圖）上根據(jù)液滴標(biāo)記，計算目標(biāo)結(jié)構(gòu)的位置并標(biāo)記到FIB圖像中（紅圈中的紅點(diǎn)）。離子束圖像由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。
該軟件通過對X、Y、Z信號進(jìn)行高斯擬合，精準(zhǔn)確定液滴的中心。近期的改進(jìn)增加了半自動液滴檢測功能以及其他功能，從而更加方便地執(zhí)行冷凍FIB工作流程。(SerialFIB, Klumpes等人，2021）。
在網(wǎng)格條上選擇圍繞最終目標(biāo)結(jié)構(gòu)的幾處液滴，作為切片處理的坐標(biāo)系�；居嬎惴椒ㄊ强紤]縮放、旋轉(zhuǎn)以及平移之后的線性仿射變換最后，在LM圖像中選擇目標(biāo)結(jié)構(gòu)并疊加到FIB圖像上。
根據(jù)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的位置，就可以定位切片窗口(圖10)。
圖10：定位切片窗口左：離子束細(xì)胞圖像，含有標(biāo)記液滴和目標(biāo)結(jié)構(gòu)根據(jù)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的計算位置，在所用FIB-SEM的切片軟件中，交互定位上下切片窗口的位置（細(xì)薄條紋上方和下方的紅色方塊）。圖像由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。
Coral Cryo工作流程具有哪些優(yōu)勢？
Coral Cryo軟件工作流程旨在為基于液滴的靶區(qū)定位工作流程提供支持。它可以提供創(chuàng)建合焦相機(jī)概覽圖像所需的成像作業(yè)（圖6和圖7）。所有必要的自動對焦功能均可以正確調(diào)整并分配，并且可以標(biāo)記潛在薄片位置，同時能夠在定義的位置執(zhí)行超分辨率共聚焦Z-堆棧。
在定位管理器（圖11）中，可以確定所有必要的坐標(biāo)標(biāo)記，并且以開放格式（*.xml）提供。此類圖像會自動保存，其數(shù)據(jù)格式可以導(dǎo)入任何FIB-SEM軟件。
圖11：Coral Cryo軟件模塊標(biāo)記點(diǎn)、薄片和液滴標(biāo)記均可以在軟件工作流程中定義。反射圖像中細(xì)胞的頂部和底部坐標(biāo)值可以作為在FIB SEM中正確計算靶區(qū)3D位置的額外參考。本文前述部分圖像中的相同細(xì)胞經(jīng)過突出顯示，用于標(biāo)記定義。
對齊標(biāo)記用于使用相機(jī)概覽圖像對標(biāo)記點(diǎn)進(jìn)行初步的粗略對齊。薄片標(biāo)記具有雙重用途：作為進(jìn)行超分辨率共聚焦3D掃描的位置標(biāo)記，或者在圖像采集后，作為靶結(jié)構(gòu)的精確3D標(biāo)記。亞像素插值確保該階段可以在3D圖像內(nèi)進(jìn)行高精度定位。最后，插值方法還用于標(biāo)記液滴坐標(biāo)，以便在FIB-SEM上進(jìn)行后續(xù)液滴關(guān)聯(lián)。
冷凍FIB切片
進(jìn)行必要的關(guān)聯(lián)并設(shè)置切片窗口，薄片位置通常會粗略切薄至大約1微米，隨后進(jìn)行最終的拋光步驟以達(dá)到電子透明（圖12）。
圖12：目標(biāo)薄片的離子束圖像以及SEM俯視圖圖像由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：10微米。
采用兩步方法的原因在于冰污染和/或切片材料可能會沉積在薄片上。為避免在最終薄片上發(fā)生冰污染，建議采用快速拋光工藝（Schaffer M.等人，2017）。還可以采用開源的商業(yè)軟件，以自動方式進(jìn)行切片。
冷凍透射電子顯微鏡
進(jìn)行冷凍FIB切片之后，含有薄片的網(wǎng)格轉(zhuǎn)移至冷凍TEM，通過對網(wǎng)格（連同薄片）逐漸傾斜，采集一系列斷層掃描圖像。圖像經(jīng)過計算處理以重建所記錄體積的3D斷層掃描圖像。通過對樣品的多個圖像取平均值，可以降低固有噪點(diǎn)，從而對蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物等顆粒獲得更高分辨率的結(jié)構(gòu)。這種處理方式稱為亞斷層圖像平均（Wan和Briggs，2016；Zhang 2019）。從概念上說，這相當(dāng)于通過單顆粒成像（SPA），在原位實(shí)現(xiàn)對大分子的亞納米分辨率。
總 結(jié)
本文旨在表明冷凍共聚焦顯微鏡是冷凍工作流程中的一個重要組成部分，用于評估EM網(wǎng)格上玻璃化樣品的質(zhì)量和靶分布。在冷凍條件下記錄的高分辨率共聚焦數(shù)據(jù)使科學(xué)家能夠在3D熒光下識別目標(biāo)結(jié)構(gòu)。此外，3D體積可作為相關(guān)方法的參考，以便在FIB-SEM中檢索靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行切片，然后在冷凍TEM中進(jìn)行電子斷層掃描，以獲得靶區(qū)的亞納米分辨率圖像。
Coral Cryo工作流程搭配新的共聚焦平臺STELLARIS，再加上Coral Cryo軟件，可以幫助新手用戶創(chuàng)建網(wǎng)格概覽圖像、超分辨率3D圖像以及精確的坐標(biāo)標(biāo)記，為后續(xù)的FIB切片和冷凍電子斷層掃描奠定堅實(shí)基礎(chǔ)。
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