熒光染料的發(fā)光原理及科研中常用種類

在這個(gè)充滿探索與發(fā)現(xiàn)的科研時(shí)代，每一個(gè)細(xì)微的細(xì)胞活動(dòng)都蘊(yùn)藏著生命的奧秘，熒光染料可以標(biāo)記微觀世界中的精細(xì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大小分子，使生命科學(xué)研究變得絢爛多彩，為我們開啟了探索之門。AbMole為您介紹熒光染料的發(fā)光原理、主要種類和一些熱門染料的應(yīng)用。

一、熒光染料的發(fā)光原理
熒光染料是指吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出另一波長(zhǎng)大于吸收光光波的物質(zhì)，它們一般含有若干個(gè)芳香族基團(tuán)，這些基團(tuán)具有較強(qiáng)的光吸收能力，在吸收激發(fā)光能量后，染料分子的內(nèi)部能量狀態(tài)顯著提升，躍遷至一個(gè)不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)（S₁’）。由于激發(fā)態(tài)具有較高的能量水平，它傾向于尋求向更穩(wěn)定的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。一般有機(jī)分子會(huì)通過化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)或振動(dòng)等機(jī)械運(yùn)動(dòng)來逐步釋放能量，但經(jīng)過設(shè)計(jì)的熒光分子會(huì)先通過震動(dòng)進(jìn)入S₁狀態(tài)隨后直接以光子的形式釋放剩余的能量，即發(fā)出熒光。高品質(zhì)抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽，盡在AbMole。

二、熒光分子的主要種類
熒光分子主要有香豆素類、花菁類染料、BODIPY類、熒光素和羅丹明類等幾種類型。香豆素?zé)晒馊玖戏肿恿亢苄。�可紫外激發(fā)，一般發(fā)藍(lán)色熒光，常常作為多色熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的藍(lán)光染料�；ㄝ既玖� (Cyanine，簡(jiǎn)寫Cy) 是另一類常見的熒光染料，例如Cy3。花菁的核心結(jié)構(gòu)是兩個(gè)含氮雜環(huán)通過奇數(shù)的次甲基連接形成，每增加一個(gè)乙烯基團(tuán)，會(huì)使得光譜紅移約100nm。熒光素和羅丹明都屬于氧雜蒽染料，它們具有極高的亮度，并且其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都位于可見光譜范圍內(nèi)，但是熒光素的pKa值為6.4，因此其光譜特性在很大程度上受環(huán)境pH值的影響，這一類熒光分子種類較多，最常見的包括異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素、羅丹明，羅丹明6G、110、123等。二吡咯烷硼化合物，又名BODIPY，因其卓越的光物理特性而備受歡迎。它們具有高量子產(chǎn)率、出色的亮度、窄半峰寬的吸收和發(fā)射光譜等優(yōu)點(diǎn)。BODIPY的各種衍生物覆蓋了從綠色（BODIPY FL）到紅色（BODIPY 650/665）的大部分可見光譜范圍，基于BODIPY的熒光探針目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域。AbMole是ChemBridge中國(guó)區(qū)官方指定合作伙伴。
三、科研常用熒光染料
熒光染料在生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中起到了重要的作用，它們可以染色細(xì)胞核、細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)、線粒體、溶酶體等，也可以對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)例如凋亡、活死等進(jìn)行染色以便于大家分析，下面簡(jiǎn)單介紹一些科研中常用的熒光染料。AbMole多年持續(xù)聚焦生命科學(xué)領(lǐng)域熒光染料的開發(fā)與生產(chǎn)。

1. 細(xì)胞核染色
細(xì)胞核染料主要有DAPI和Hoechst系列產(chǎn)品。DAPI的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為350和460 nm，發(fā)藍(lán)色熒光。DAPI無法活染，一般DAPI染色前需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多聚甲醛的固定。Hoechst則可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，一般在延時(shí)成像等持續(xù)性的熒光觀察實(shí)驗(yàn)中會(huì)用到該產(chǎn)品，其最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)與DAPI相接近。
 
2. 細(xì)胞線粒體染色和線粒體膜電位檢測(cè)
MitoTracker 系列染料可以選擇性地積聚在線粒體基質(zhì)中， 通過與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應(yīng)來共價(jià)結(jié)合線粒體蛋白，從而可以對(duì)線粒體進(jìn)行染色。

線粒體膜電位對(duì)于細(xì)胞的正常能量代謝和功能維持至關(guān)重要，JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1則不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，通過流式細(xì)胞術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡等即可對(duì)細(xì)胞的膜電位進(jìn)行量化或者定性分析。
3. 活死細(xì)胞染色試劑盒：Calcein AM /PI
當(dāng)需要對(duì)細(xì)胞的存活和死亡進(jìn)行分析時(shí)，可以使用Calcein AM /PI雙重染色法。Calcein-AM可透過細(xì)胞膜但其自身并不是熒光分子，通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光 (激發(fā): 490 nm，發(fā)射: 515 nm)。因此Calcein-AM僅對(duì)活細(xì)胞染色；而PI無法染色活細(xì)胞，只能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光 (激發(fā): 535 nm，發(fā)射: 617 nm)。通過上述兩種熒光染料的雙重染色即可分辨出細(xì)胞群體中死亡和存活的細(xì)胞。
4. 凋亡檢測(cè)試劑盒：Annexin V-FITC/PI
細(xì)胞在凋亡的早期會(huì)發(fā)生磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻，而Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，利用FITC標(biāo)記Annexin V孵育細(xì)胞即可以檢測(cè)出早期凋亡的細(xì)胞，而用PI則可以檢測(cè)出已經(jīng)死亡的細(xì)胞。通常該試劑盒被用于凋亡細(xì)胞的流式定量。
5. 活性氧探針DCFH-DA
活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是機(jī)體進(jìn)行正常有氧代謝的產(chǎn)物，含氧并且性質(zhì)活潑的一類物質(zhì)的總稱。包含超氧陰離子（O₂^-）、過氧化氫（H₂O₂）、羥自由基（OH-）、臭氧（O₃）和單線態(tài)氧（¹O₂）等，由于它們含有不成對(duì)的電子，因此具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性。DCFH-DA具有較強(qiáng)的非極性可以自由進(jìn)出細(xì)胞膜，但當(dāng)它被胞內(nèi)的酯酶水解后則無法透過細(xì)胞膜，并且在被ROS氧化成DCF后具有熒光發(fā)光的能力。
6. 脂質(zhì)過氧化物探針
BODIPY C11 581/591可用于檢測(cè)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化情況。該染料可以插入細(xì)胞膜中，如果在細(xì)胞膜中發(fā)生氧化，則該染料的多不飽和丁二烯基部分的熒光發(fā)射峰從590 nm移動(dòng)到510 nm，發(fā)綠色熒光。而在還原狀態(tài)下，BODIPY C11 581/591 十一烷酸的激發(fā)和發(fā)射最大值為 581/591 nm，發(fā)紅色熒光。目前，該染料是鐵死亡研究的常用產(chǎn)品。

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，熒光染料扮演著重要的角色，AbMole為您推薦：

 

產(chǎn)品名稱	目錄號(hào)	Ex&Em  顏色	產(chǎn)品描述
LysoTracker Red	M21524	577/590 nm 紅色	溶酶體標(biāo)記
PKH-26 (red)	M21701	551/567 nm 黃色	外泌體及細(xì)胞標(biāo)記
Nile Red	M5118	543/598 nm 紅色	可用于脂類及蛋白質(zhì)等的染色
2-NBDG	M6327	488/542 nm 黃色	示蹤葡萄糖的攝取和代謝
MitoSOX Red	M19992	510/580 nm 紅色	線粒體標(biāo)記
MitoTracker Red CMXRos	M19979	579/599 nm 紅色	線粒體標(biāo)記
Rhodamine 123	M11522	508/530 nm 綠色	線粒體標(biāo)記
TMRE	M9743	550/576 nm 黃色	線粒體標(biāo)記
DiOC6(3) iodide	M11521	484/500 nm 綠色	線粒體膜電位檢測(cè)
TMRM Perchlorate	M9542	550/576 nm 黃色	線粒體膜電位檢測(cè)
Green DND-26	M45073	504/511 nm 綠色	溶酶體標(biāo)記
ER-Tracker Green	M55398	504/511 nm 綠色	內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記
ER-Tracker Red	M45074	587/615 nm 紅色	內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記
Phalloidin-TRITC	M51704	550/570 nm 紅色	F-actin蛋白標(biāo)記
Phalloidin-iFluor 488 Conjugate	M21689	491/516 nm 綠色	F-actin蛋白標(biāo)記
Calcein-AM	M5114	490/515 nm 綠色	活細(xì)胞標(biāo)記
Fluorescein diacetate (FDA)	M5115	488/530 nm 綠色	活細(xì)胞標(biāo)記
Propidium Iodide	M5108	535/615 nm 紅色	細(xì)胞凋亡和壞死檢測(cè)
CFDA-SE	M5117	500/520 nm 綠色	細(xì)胞增殖檢測(cè)
BODIPY 493/503	M9850	493/503 nm 綠色	脂質(zhì)染色
DiR	M5122	748/780 nm 紅外	細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)染色
DiI	M5120	549/565 nm 黃色	細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)染色
FM1-43	M54634	510/626 nm 紅色	細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)染色
FM4-64	M28704	558/734 nm 紅外	細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)染色
ABDA	M31290	測(cè)400 nm吸光度	單線態(tài)氧檢測(cè)
Dihydroethidium	M9696	可變（氧化前370/420 nm；氧化后300/610 nm）	超氧化物陰離子檢測(cè)
Hydroethidine	M40970	520/600 nm 紅色	過氧化物及細(xì)胞缺氧檢測(cè)
FerroOrange	M42835	543/580 nm 橙色	亞鐵離子檢測(cè)
FeRhoNox-1 (Fe2+ indicator)	M21552	540/570 nm 黃色	亞鐵離子檢測(cè)
Fura-2 AM	M9807	336/505 nm 綠色	鈣離子檢測(cè)
Fluo-3 AM	M9960	488/526 nm 綠色	鈣離子檢測(cè)
Rhod-2 AM	M10357	552/581 nm 黃色	鈣離子檢測(cè)
Zinquin	M55292	355/491 nm 藍(lán)色	鋅離子探針
Zinpyr-1	M29845	可變（507-515/513-558 nm）	鋅離子探針
MQAE	M13793	350/460 nm 藍(lán)色	氯離子探針
BCECF-AM	M9520	488/535 nm 綠色	胞內(nèi)pH檢測(cè)
IR808	M11151	782/808 nm 紅外	產(chǎn)生ROS并可在腫瘤部位積累和成像
Fluorescein Sodium	M10272	490/530 nm 綠色	造影劑
D-Luciferin potassium salt	M8873	化學(xué)發(fā)光，檢測(cè)波長(zhǎng)560 nm 黃色	活體成像
AkaLumine	M13768	化學(xué)發(fā)光，檢測(cè)波長(zhǎng)675 nm 近紅外	熒光素類似物，可被熒光蛋白降解并發(fā)光
Indocyanine green	M3577	785/813 nm紅外	活體成像
CY5-SE	M13775	640/670 nm 紅外	體內(nèi)外生物大分子標(biāo)記
ICG-OSu	M21459	789/814 nm 近紅外	體內(nèi)外生物大分子標(biāo)記
Acridine Orange	M6404	488/520 nm綠色	核DNA和RNA染色
FITC-Dextran	M43972	495/525 nm 綠色	生物物質(zhì)示蹤
Coelenterazine	M9267	/	超氧陰離子及過氧亞硝酸鹽檢測(cè)