腦-心膽堿能突觸-鈣信號傳導(dǎo)介導(dǎo)缺血性卒中誘發(fā)房顫的機(jī)制研究

3. 缺血性卒中引起的鈣瞬變（CaT）改變可被穩(wěn)心顆粒（WK）恢復(fù)
鈣瞬變受細(xì)胞內(nèi)鈣信號調(diào)節(jié)，在竇性心律中，缺血性卒中鈣瞬變發(fā)生變化，包括 CaT90 延長等，而 WK 不同劑量組及美托洛爾可改善這些變化。6 Hz 刺激條件下顯示腦缺血引起的 CaT90 延長等可被穩(wěn)心顆粒或美托洛爾改善。通過縮短周期長度誘導(dǎo)心房交替變化，模型組的 CaT 交替變化比率在特定時間段高于假手術(shù)組，而 WK 不同劑量組及美托洛爾可部分減輕這種交替變化比率。（圖2）

通過不同方法展示鈣瞬變恢復(fù)過程，發(fā)現(xiàn) ISIAF 大鼠心臟鈣瞬變恢復(fù)曲線陡度增加及衰減時間常數(shù)增加，WK 和美托洛爾可改善，單細(xì)胞鈣成像和缺血性卒中大鼠實驗進(jìn)一步支持 ISIAF 大鼠模型有效及穩(wěn)心顆粒的作用。（圖3）

 
圖3. 展示在有或沒有穩(wěn)心顆粒治療的缺血性卒中誘導(dǎo)的房顫模型中，與房顫相關(guān)的變化以及鈣釋放的恢復(fù)情況

4. 篩選出由缺血性卒中誘導(dǎo)的房顫 (ISIAF) 改變且能被穩(wěn)心顆粒恢復(fù)的心房基因
對假手術(shù)組、模型組和 WK 治療組大鼠心房組織進(jìn)行 RNA-seq 分析。確定了受 WK 調(diào)節(jié)的基因，表明離子通道等相關(guān)過程重要，膽堿能突觸信號通路在受 WK 影響的經(jīng)典通路中排第一，圖10 展示了部分基因變化值及 WK 改善 ISIAF 的機(jī)制示意圖。

圖4. ISIAF 及 WK 治療下大鼠心房的轉(zhuǎn)錄組測序和 IPA 分析

圖10. 膽堿能和鈣信號通路在 ISIAF 及 WK 治療在神經(jīng)元和非神經(jīng)元（心臟）系統(tǒng)中的作用示意圖
由 ISIAF 上調(diào)的基因（CHAT、SLC5A7、AChE、CACNB1、ATP2A3 和 CHRM3）用紅色箭頭表示
被 WK 下調(diào)的基因（CHAT、SLC5A7、AChE、CACNB1、ATP2A3 和 CHRM3）用藍(lán)色條紋標(biāo)記

5. WK 對 ICa-L 的影響
根據(jù)圖5 所示，WK 極大地抑制 L 型鈣電流峰值。不同濃度的 WK 對 ICa-L 有影響，濃度升高時，ICa-L 逐漸被抑制，且有最大半抑制濃度。WK 對穩(wěn)態(tài)激活電壓和 ICa-L 失活有影響，使激活和失活的值都有發(fā)生變化。在特定條件下，注入含 WK 的細(xì)胞外液后，ICa-L 激活的峰值電流密度降低，I-V 曲線向上移動但部分電位和曲線形狀未變。

圖5. WK 對 L 型鈣離子通道動力學(xué)調(diào)節(jié)的驗證

6. 篩選出與 CACNB1 和 CHRM3 相互作用的穩(wěn)心顆粒（WK）活性成分
為檢測 WK 進(jìn)入大鼠血漿的活性成分，分析不同樣本，確定 WK 有 40 種化學(xué)成分及 21 種入血成分。通過分子對接篩選出與 CACNB1 和 CHRM3 高親和力的前 5 種化合物，并用模型描繪其關(guān)系，還指出部分入血成分情況。

圖6. 大鼠血漿中 WK 活性成分的化學(xué)圖譜

圖7. 通過分子對接針對毒蕈堿型乙酰膽堿受體 M3（CHRM3）和鈣電壓門控通道輔助亞基 β1（CACNB1）的 WK 活性化合物的虛擬篩選

8. WK 的活性化合物對 L 型鈣電流（I_Ca-L）的影響人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rg1、白術(shù)內(nèi)酯 Ⅱ、丹參酮 ⅡA、隱丹參酮和甘松新酮（濃度為 10、50 和 100 µmol/L)）對 I_{Ca - L} 無明顯抑制作用。而隨著薯蕷皂苷濃度（1、3、10、30 µmol/L)）升高，I_{Ca - L} 逐漸受到限制，薯蕷皂苷以濃度依賴的方式降低 I_{Ca - L}，其最大半抑制濃度（IC50）為 8.666±0.777 µmol/L)，在不同濃度下薯蕷皂苷可劑量依賴性地降低 I_{Ca - L}。

圖8. WK 活性化合物對大鼠心房肌細(xì)胞 I_Ca-L 的影響

9. WK 及其活性化合物對乙酰膽堿（Ach）激活的 HL-1 細(xì)胞的影響
HL-1 細(xì)胞研究表明，薯蕷皂苷濃度高于 100 µmol/L 時降低細(xì)胞活力，且能降低乙酰膽堿激活的 HL-1 細(xì)胞中 CHRM3 表達(dá)，1mg/mL WK 和 1 µmol/L 薯蕷皂苷作用與 CHRM3 抑制劑相似。

圖9. WK 活性化合物對 HL-1 細(xì)胞中毒蕈堿型乙酰膽堿受體 M3（CHRM3）激活的影響

研究結(jié)論：
該研究首次建立了缺血性卒中誘導(dǎo)的房顫（ISIAF）大鼠模型，并描述了腦缺血后心房電生理變化。分子機(jī)制分析表明，膽堿能突觸和鈣信號通路在這種腦心綜合征中起著核心作用。值得注意的是，通過使用復(fù)方中藥穩(wěn)心顆粒治療，ISIAF 可部分逆轉(zhuǎn)，穩(wěn)心顆粒通過調(diào)節(jié)相同的膽堿能突觸 - 鈣信號通路發(fā)揮作用。其活性成分之一薯蕷皂苷通過與 IKM3 結(jié)合并抑制 ICa-L 直接發(fā)揮作用。

本文章天津中醫(yī)藥大學(xué)朱彥教授和河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院電生理研究所所長郝國梁為共同通訊作者，天津中醫(yī)藥大學(xué)2021級博士研究生梁英然和河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院電生理研究所副所長王功新為文章的并列第一作者。

原文鏈接：
Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation (thno.org)